簡介
定義
反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合矽膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是當今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用於所有能溶於極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。 反相色譜法適於分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務皆由反相色譜法完成。
反相高效液相色譜是化學鍵合相色譜法的一種。化學鍵合相色譜法是由液液色譜法發展起來的,是為了解決在分離過程中,機械吸附在載體上的固體液的流失問題而發展出來的一種新方法。鍵合相色譜法通過將不同的有機官能團通過化學反應共價鍵合到矽膠載體表面的游離經基上,而生成化學鍵合固定相,化學鍵合固定相對各種極性溶劑
都有良好的化學穩定性和熱穩定性。由它製備的色譜主柱效高、使用壽命長、重現性好,幾乎對各種類型的有機化合物都呈現良好的選擇性,並可用於梯度洗脫操作,消除了分配色譜法的缺點。
根據鍵合固定相和流動相相對極性的強弱,可將鍵合色譜法分為正相鍵合色譜法和反相鍵合色譜法.反相鍵合色譜法即反相高效液相色譜.在正相鍵合色譜法中,鍵合固定相的極性大於流動相的極性,適用於分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物.在反相鍵合相色譜法中,鍵合固定相的極性小於流動相的極性適用於分離非極性、極性或
離子型化合物,其套用範圍也比正相鍵合相色譜法更廣泛。
原理
在反相鍵合相色譜法中使用的是非極性鍵合固定相。它是將全多孔(或薄殼)微粒矽膠載體,經酸活化處理後與含輕基鏈(c4、C8、C18)或苯基的矽烷化試劑反應,生成表面具有烷基或苯基的非極性固定相。如共價結合到載體上的直鏈碳氫化合物正辛基等。關於反相色譜的分離機理,吸附色譜的作用機制認為溶質在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。根據疏溶劑理論,當溶質分子進入極性流動相後,即占據流動相中相應的空間,而排擠一部分溶劑分子。當溶質分子被流動相推動與固定相接觸時,溶質分子的非極性部分或非極性因子會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開,而直接與非極性固定相上的烷基官能團相結合(吸附)形成締合絡合物,構成單分子吸附層。這種疏溶劑的吸附作用是可逆的,當流動相極性減少時,這種疏溶劑斥力下降,會發生解締,並將溶質分子解放而被洗脫下來 。
影響溶質保留值的三個因素
烷基鍵合固定相對每種溶質分子締合作用和解締作用能力之差,就決定了溶質分子在色譜過程的保留值。以下簡述影響溶質保留值的三個因素:
1）溶質分子結構
在反相鍵合相色譜法中,溶質的分離是以它們的疏水結構差異為依據的,溶質的極性越弱,疏水性也強,保留值越大。根據疏溶劑理論,溶質的保留值與其分子中非極性部分的總表面積有關,其與烷基鍵合固定相結出的面積愈人,保留值越大。
2) 烷基鍵合固定相的特性
烷基鍵合固定相的作用在於提供非極性作用表面,因此鍵合到矽膠表面的烷基數量就決定著溶質容量因子的大小。烷基的疏水特性隨碳鏈的加長而增加,溶質的保留值也隨著烷基碳鏈長度的增加而增人。隨著烷基碳鏈的增長,增加了鍵合相的非極性作用的表面積,其不僅影響溶質的保留值,還影響色譜柱的選擇性,即隨烷基碳鏈的加長其對溶質分離的選擇性也增大。
3) 流動相性質
流動相的表面張力愈大,介電常數愈大,其極性越強,此時溶質與烷基鍵合相得締合能力越強,流動相的洗脫強度弱,導致溶質的保留值越大。
套用舉例
工業生產中的套用
隨著技術的不斷改進,反相高效液相色譜法獲得日益廣泛的套用,在高效液相色譜法中也占有重要的地位。自冬梅等人提出了一種利用反相高效液相色譜法分析米根霉乳酸發酵液中有機酸的方法。套用反相認值kosil一11SC18RS色譜柱,以0.olmol/L磷酸P(H2.5)作為流動相,發酵液經稀硫酸預處理後直接進樣分離定量,在10mni內把其中的乳酸、蘋果酸、富馬酸等完全分離定量,各種酸回收率大於97%。
其實驗結果證明,該方法能將米根霉乳酸發酵液中乳酸、蘋果酸和富馬酸完全分離並準確定量。本方法具有前處理簡單、干擾小、靈敏度高、分析速度快等優點,對於及時測定乳酸發酵過程的變化具有重要意義,是測定乳酸發酵液中各有機酸的快速、有效的定量測定方法 。
藥代動力學中的套用
高效液相色譜在藥物代謝動力學上的研究主要是為藥物代謝動力學軟體提供數據,並最終通過藥代動力學軟體處理得到藥物動力學結果。其中動力學參數主要集中在:吸收半衰期(tl/2。)、消除半衰期(t1126)、達峰時(tma)、最大血藥濃度(Cmax)、曲線下面積AUC、消除率CIB、表觀分布容積Vd等。通過這些動力學參數對藥物代謝動力學進行研究,並通過這種方法對藥物對機體的作用情況進行比較,有利的指導藥物的開發和研製,在這個方向的研究可能是高效液相色譜與藥代動力學軟體聯用分析的發展方向 。
