簡介
生物型原子力顯微鏡原理
概括
原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope，簡稱AFM）利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細探針與受測樣品原子之間的作用力，從而達到檢測的目的，具有原子級的解析度。由於原子力顯微鏡既可以觀察導體，也可以觀察非導體，從而彌補了掃描隧道顯微鏡的不足。原子力顯微鏡是由IBM公司蘇黎世研究中心的格爾德·賓寧於一九八五年所發明的，其目的是為了使非導體也可以採用類似掃描探針顯微鏡（SPM）的觀測方法。原子力顯微鏡（AFM）與掃描隧道顯微鏡（STM）最大的差別在於並非利用電子隧穿效應，而是檢測原子之間的接觸，原子鍵合，范德瓦耳斯力或卡西米爾效應等來呈現樣品的表面特性。詳細
圖1. 雷射檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖如圖1所示，二極體雷射器（LaserDiode）發出的雷射束經過光學系統聚焦在微懸臂（Cantilever）背面，並從微懸臂背面反射到由光電二極體構成的光斑位置檢測器（Detector）。在樣品掃描時，由於樣品表面的原子與微懸臂探針尖端的原子間的相互作用力，微懸臂將隨樣品表面形貌而彎曲起伏，反射光束也將隨之偏移，因而，通過光電二極體檢測光斑位置的變化，就能獲得被測樣品表面形貌的信息。
子力顯微鏡——原理圖優缺點
優點
原子力顯微鏡觀察到的圖像缺點
和掃描電子顯微鏡(SEM）相比，AFM的缺點在於成像範圍太小，速度慢，受探頭的影響太大。儀器結構
力檢測部分
原子力顯微鏡位置檢測部分
在原子力顯微鏡（AFM）的系統中，當針尖與樣品之間有了互動作用之後，會使得懸臂cantilever擺動，當雷射照射在微懸臂的末端時，其反射光的位置也會因為懸臂擺動而有所改變，這就造成偏移量的產生。在整個系統中是依靠雷射光斑位置檢測器將偏移量記錄下並轉換成電的信號，以供SPM控制器作信號處理。反饋系統
在原子力顯微鏡（AFM）的系統中，將信號經由雷射檢測器取入之後，在反饋系統中會將此信號當作反饋信號，作為內部的調整信號，並驅使通常由壓電陶瓷管制作的掃描器做適當的移動，以保持樣品與針尖保持一定的作用力。總結
AFM系統使用壓電陶瓷管制作的掃描器精確控制微小的掃描移動。壓電陶瓷是一種性能奇特的材料，當在壓電陶瓷對稱的兩個端面加上電壓時，壓電陶瓷會按特定的方向伸長或縮短。而伸長或縮短的尺寸與所加的電壓的大小成線性關係。即可以通過改變電壓來控制壓電陶瓷的微小伸縮。通常把三個分別代表X，Y，Z方向的壓電陶瓷塊組成三角架的形狀，通過控制X，Y方向伸縮達到驅動探針在樣品表面掃描的目的；通過控制Z方向壓電陶瓷的伸縮達到控制探針與樣品之間距離的目的。原子力顯微鏡（AFM）便是結合以上三個部分來將樣品的表面特性呈現出來的：在原子力顯微鏡（AFM）的系統中，使用微小懸臂（cantilever）來感測針尖與樣品之間的相互作用，這作用力會使微懸臂擺動，再利用雷射將光照射在懸臂的末端，當擺動形成時，會使反射光的位置改變而造成偏移量，此時雷射檢測器會記錄此偏移量，也會把此時的信號給反饋系統，以利於系統做適當的調整，最後再將樣品的表面特性以影像的方式給呈現出來。
工作模式
接觸模式
從概念上來理解，接觸模式是AFM最直接的成像模式。AFM在整個掃描成像過程之中，探針針尖始終與樣品表面保持緊密的接觸，而相互作用力是排斥力。掃描時，懸臂施加在針尖上的力有可能破壞試樣的表面結構，因此力的大小範圍在10-10～10-6N。若樣品表面柔嫩而不能承受這樣的力，便不宜選用接觸模式對樣品表面進行成像。非接觸模式
非接觸模式探測試樣表面時懸臂在距離試樣表面上方5～10nm的距離處振盪。這時，樣品與針尖之間的相互作用由范德華力控制，通常為10-12N，樣品不會被破壞，而且針尖也不會被污染，特別適合於研究柔嫩物體的表面。這種操作模式的不利之處在於要在室溫大氣環境下實現這種模式十分困難。因為樣品表面不可避免地會積聚薄薄的一層水，它會在樣品與針尖之間搭起一小小的毛細橋，將針尖與表面吸在一起，從而增加尖端對表面的壓力。敲擊模式
敲擊模式介於接觸模式和非接觸模式之間，是一個雜化的概念。懸臂在試樣表面上方以其共振頻率振盪，針尖僅僅是周期性地短暫地接觸/敲擊樣品表面。這就意味著針尖接觸樣品時所產生的側向力被明顯地減小了。因此當檢測柔嫩的樣品時，AFM的敲擊模式是最好的選擇之一。一旦AFM開始對樣品進行成像掃描，裝置隨即將有關數據輸入系統，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰頂之間的最大距離等，用於物體表面分析。同時，AFM還可以完成力的測量工作，測量懸臂的彎曲程度來確定針尖與樣品之間的作用力大小。三種模式的比較
接觸模式（ContactMode）：優點：掃描速度快，是唯一能夠獲得“原子解析度”圖像的AFM垂直方向上有明顯變化的質硬樣品，有時更適於用ContactMode掃描成像。
缺點：橫向力影響圖像質量。在空氣中，因為樣品表面吸附液層的毛細作用，使針尖與樣品之間的粘著力很大。橫向力與粘著力的合力導致圖像空間解析度降低，而且針尖刮擦樣品會損壞軟質樣品（如生物樣品，聚合體等）。
非接觸模式：
優點：沒有力作用於樣品表面。
缺點：由於針尖與樣品分離，橫向解析度低；為了避免接觸吸附層而導致針尖膠粘，其掃描速度低於TappingMode和ContactModeAFM。通常僅用於非常怕水的樣品，吸附液層必須薄，如果太厚，針尖會陷入液層，引起反饋不穩，刮擦樣品。由於上述缺點，on-contactMode的使用受到限制。
輕敲模式：
優點：很好的消除了橫向力的影響。降低了由吸附液層引起的力，圖像解析度高，適於觀測軟、易碎、或膠粘性樣品，不會損傷其表面。
缺點：比ContactModeAFM的掃描速度慢。
其他模式
除了上面三種常見的三種工作模式外，原子力顯微鏡還可以進行下面的工作：1、橫向力顯微鏡（LFM）
橫向力顯微鏡（LFM）是在原子力顯微鏡（AFM）表面形貌成像基礎上發展的新技術之一。工作原理與接觸模式的原子力顯微鏡相似。當微懸臂在樣品上方掃描時，由於針尖與樣品表面的相互作用，導致懸臂擺動，其擺動的方向大致有兩個：垂直與水平方向。一般來說，雷射位置探測器所探測到的垂直方向的變化，反映的是樣品表面的形態，而在水平方向上所探測到的信號的變化，由於物質表面材料特性的不同，其摩擦係數也不同，所以在掃描的過程中，導致微懸臂左右扭曲的程度也不同，檢測器根據雷射束在四個象限中，（A+C）-（B+D）這個強度差值來檢測微懸臂的扭轉彎曲程度。而微懸臂的扭轉彎曲程度隨表面摩擦特性變化而增減（增加摩擦力導致更大的扭轉）。雷射檢測器的四個象限可以實時分別測量並記錄形貌和橫向力數據。
2、曲線測量
SFM除了形貌測量之外，還能測量力對探針-樣品間距離的關係曲線Zt（Zs）。它幾乎包含了所有關於樣品和針尖間相互作用的必要信息。當微懸臂固定端被垂直接近，然後離開樣品表面時，微懸臂和樣品間產生了相對移動。而在這個過程中微懸臂自由端的探針也在接近、甚至壓入樣品表面，然後脫離，此時原子力顯微鏡（AFM）測量並記錄了探針所感受的力，從而得到力曲線。Zs是樣品的移動，Zt是微懸臂的移動。這兩個移動近似於垂直於樣品表面。用懸臂彈性係數c乘以Zt，可以得到力F=c·Zt。如果忽略樣品和針尖彈性變形，可以通過s=Zt-Zs給出針尖和樣品間相互作用距離s。這樣能從Zt（Zs）曲線決定出力-距離關係F（s）。這個技術可以用來測量探針尖和樣品表面間的排斥力或長程吸引力，揭示定域的化學和機械性質，像粘附力和彈力，甚至吸附分子層的厚度。如果將探針用特定分子或基團修飾，利用力曲線分析技術就能夠給出特異結合分子間的力或鍵的強度，其中也包括特定分子間的膠體力以及疏水力、長程引力等。
3、納米加工
掃描探針納米加工技術是納米科技的核心技術之一，其基本的原理是利用SPM的探針－樣品納米可控定位和運動及其相互作用對樣品進行納米加工操縱，常用的納米加工技術包括：機械刻蝕、電致/場致刻蝕、浸潤筆（Dip-PenNano-lithography，DNP）等。
對樣品的要求
原子力顯微鏡研究對象可以是有機固體、聚合物以及生物大分子等，樣品的載體選擇範圍很大，包括雲母片、玻璃片、石墨、拋光矽片、二氧化矽和某些生物膜等，其中最常用的是新剝離的雲母片，主要原因是其非常平整且容易處理。而拋光矽片最好要用濃硫酸與30%雙氧水的7∶3混合液在90℃下煮1h。利用電性能測試時需要導電性能良好的載體，如石墨或鍍有金屬的基片。試樣的厚度，包括試樣台的厚度，最大為10mm。如果試樣過重，有時會影響Scanner的動作，請不要放過重的試樣。試樣的大小以不大於試樣台的大小（直徑20mm）為大致的標準。稍微大一點也沒問題。但是，最大值約為40mm。如果未固定好就進行測量可能產生移位。請固定好後再測定。
套用
隨著科學技術的發展，生命科學開始向定量科學方向發展。大部分實驗的研究重點已經變成生物大分子，特別是核酸和蛋白質的結構及其相關功能的關係。因為AFM的工作範圍很寬，可以在自然狀態（空氣或者液體）下對生物醫學樣品直接進行成像，解析度也很高。因此，AFM已成為研究生物醫學樣品和生物大分子的重要工具之一。AFM套用主要包括三個方面：生物細胞的表面形態觀測；生物大分子的結構及其他性質的觀測研究；生物分子之間力譜曲線的觀測。AFM對生物細胞的表面形態觀察
AFM可以用來對細胞進行形態學觀察，並進行圖像的分析。通過觀察細胞表面形態和三維結構，可以獲得細胞的表面積、厚度、寬度和體積等的量化參數等。例如，利用AFM可以對感染病毒後的細胞表面形態的改變、造骨細胞在加入底物（鈷鉻、鈦、鈦釩等）後細胞形態和細胞彈性的變化、GTP對胰腺外分泌細胞囊泡高度的影響進行研究。利用AFM還可以對自由基損傷的紅細胞膜表面精細結構的研究，直接觀察到自由基損傷，以及加女貞子保護作用後，對紅細胞膜分子形態學的影響。
生物大分子的結構及其他性質的觀測研究
2.1蛋白質
對於蛋白質，AFM的出現極大的推動了其研究進展。AFM可以觀察一些常見的蛋白質，諸如白蛋白，血紅蛋白，胰島素及分子馬達和噬菌調理素吸附在圖同固體界面上的行為，對於了解生物相溶性，體外細胞的生長，蛋白質的純化，膜中毒有很大幫助。例如，Dufrene等利用AFM考察了吸附在高分子支撐材料表面上的膠原蛋白的組裝行為。結合X-射線光電子能譜技術和輻射標記技術，他們提出了一個定性解釋其層狀結構的幾何模型。AFM實驗證實了膠原蛋白組裝有時連續，有時不連續的性質，通過形貌圖也提供了膠原蛋白纖維狀結構特徵。Quist等利用AFM研究了白蛋白和豬胰島素在雲母基底上的吸附行為，根據AFM圖上不同尺寸的小丘狀物質推測，蛋白質有時發生聚集，有時分散分布。Epand等則利用AFM技術研究了一類感冒病毒的紅血球凝集素，首次展示了一種膜溶原蛋白自組裝形成病毒摺疊蛋白分子外域的實時過程。
在AFM觀察包裹有紫膜的噬菌調理素蛋白（BR)的研究中，AFM儀器的改進，檢測技術的提高和制樣技術的完善得到了集中的體現。在細胞中，分子馬達可以將化學能轉變為機械運動，防止因為布朗運動導致的細胞中具有方向性的活動出現錯誤，這些活動包括：肌漿球蛋白，運動蛋白，動力蛋白，螺鏇酶，DNA聚合酶和RNA聚合酶等分子馬達蛋白的共同特點是沿著一條線性軌道執行一些與生命活動息息相關的功能，比如肌肉的收縮，細胞的分化過程中染色體的隔離，不同細胞間的細胞器的置換以及基因信息的解碼和複製等。由於分子馬達本身的微型化，它們容易受更高的熱能和大的波動的影響，了解馬達分子如何正常有序工作就成為一項具有挑戰性的任務。利用AFM，人們已經知道了肌動蛋白結合蛋白的結構信息和細胞運動過程中肌動蛋白骨架調控功能。
2.2脫氧核糖核酸(DNA)
AFM液相成像技術的優點在於消除了毛細作用力，針尖粘滯力，更重要的是可以在接近生理條件下考察DNA的單分子行為。DNA分子在緩衝溶液或水溶液中與基底結合不緊密，是液相AFM面臨的主要困難之一。矽烷化試劑,如3-氨丙基三乙氧基矽烷（APTES）和陽離子磷脂雙層修飾的雲母基底固定DNA分子，再在緩衝液中利用AFM成像，可以解決這一難題。在氣相條件下陽離子參與DNA的沉積已經發展十分成熟，適於AFM觀察。在液相條件下，APTES修飾的雲母基底較常用。目前DNA的許多構象諸如彎曲，超螺鏇，小環結構，三鏈螺鏇結構，DNA三通接點構象，DNA複製和重組的中間體構象，分子開關結構和藥物分子插入到DNA鏈中的相互作用都廣泛地被AFM考察，獲得了許多新的理解。
2.3核糖核酸(RNA)
AFM對RNA的研究還不是很多。結晶的轉運RNA和單鏈病毒RNA以及寡聚Poly(A)的單鏈RNA分子的AFM圖像已經被獲得。因為在於不同的緩衝條件下，單鏈RNA的結構變化十分複雜，所以單鏈RNA分子的圖像不容易採集。（利用AFM成像RNA分子需要對樣品進行特殊和複雜的處理。Bayburt等借鑑Ni2+固定DNA的方法在緩衝條件下獲得了單鏈Pre-mRNA分子的AFM圖像。他們的做法如下：(1)用酸處理被Ni2+修飾的雲母基底以增加結合力；(2)RNA分子在70℃退火，慢慢將其冷卻至室溫再滴加在用酸處理過的Ni2+-雲母基底上。採用AFM單分子力譜技術，在Mg2+存在的溶液中，Liphardt等研究了形貌多變的RNA分子的機械去摺疊過程，發現了從髮夾結構到三螺鏇連線體這些RNA分子三級結構的過渡態。隨後他們又利用RNA分子證實了可逆非平衡功函和可逆平衡自由能在熱力學上的等效性。）
2.4核酸與蛋白質複合物(Nuclearacids-ProteinComplex)
DNA和蛋白質分子的特定相互作用在分子生物學中起著關鍵作用。蛋白質與DNA結合的精確位點圖譜和不同細胞狀態下結合位點的測定對於了解複雜細胞體系的功能與機理，特別是基因表達的控制都十分關鍵。AFM作為一種高度分辨達0。1nm，寬度解析度為2nm左右的表面分析技術，已廣泛地用於表征各類DNA-蛋白質的複合物。低濕度大氣條件下，Rees等利用AFM在接觸模式下考察了λ2PL啟動子在啟動和關閉轉錄過程中對DNA鏈彎曲程度的影響。此外，這個小組還研究了另外一種λ2轉錄因子，Cro-蛋白對DNA彎曲的影響。為了研究Jun蛋白的結合是否會引起DNA鏈的彎曲，Becker等利用AFM研究了包含一個AP21結合位點的線性化質粒DNA與Jun蛋白的複合物。Aizawa小組對DNA蛋白激酶Ku亞結構域和雙鏈DNA斷裂的相關性進行了研究。Kasas等研究了大腸桿菌RNA聚合酶（RNAP)轉錄過程中的動態酶活性。他們的方法是在Zn2+存在的條件下，RNAP能夠鬆散或緊密地與DNA模板進行結合，通過AFM成像了解其動態過程。
2.5細胞(Cell)
AFM不僅能夠提供超光學極限的細胞結構圖像，還能夠探測細胞的微機械特性，利用AFM力-曲線技術甚至能夠實時地檢測細胞動力學和細胞運動過程。利用AFM研究細胞很少用樣品預處理，尤其是能夠在近生理條件下對它們進行研究。
利用AFM直接成像方法，可以對固定的活細胞和亞細胞結構進行了深入研究。這些研究獲得了關於細胞器的構造，細胞膜和細胞骨架更詳細的信息。將細胞固定在基底上再進行AFM觀察，可以得到細胞膜結構的皺褶，層狀脂肪物，微端絲和微絨毛等特徵。由於細胞質膜掩蓋了細胞內部骨架，現在已經發展了一種仔細剝離該層膜的方法,並利用AFM對剝離細胞膜後的結構進行了研究。
AFM在細胞研究方面的一個最重要用途是對活細胞的動力學過程，細胞間的相互作用以及細胞對其內外干擾因素的回響進行實時成像目前，AFM已經可以對外來病毒感染的細胞進行實時考察。AFM還可以研究活性狀態下血小板形狀的變化情況和培養的胰腺細胞對澱粉消化酶的回響情況。
2.6病毒(Virus)
早期，AFM在生物學上的套用主要集中在病毒研究。Kolbe等首次研究了具有不同頭尾結構的T4噬菌體。Imai及其合作者分別對菸草花葉病毒和各類噬菌體進行了考察。菸草花葉病毒（TMV)或星形菸草花葉病毒（STMV)是迄今研究得最多的病毒類型。在膠體溶液中，TMV非常類似已知的蛋白質行為，可以採用研究蛋白質的方法對其進行考察。利用AFM，可以研究高度過飽和和輕微過飽和條件下TMV的二維成核生長過程。AFM研究表明，當TYMV暴露在平衡條件下的溶液中，TYMV晶體的（101)面逐層向上生長，晶格的結構缺陷如空位，單粒子，位錯和聚集等現象在AFM圖上區分得十分清楚。Turner等利用從AIDS病毒中提取的逆轉錄酶修飾AFM橫樑，使之成為一種能檢測抑制酶的活力和篩選使AIDS病毒失活藥物的方法。自支撐磷脂膜與感冒病毒結合作用以及缺陷位點結構上底物暴露的磷脂單層效應和水合雙層磷脂的檢測被發展成了一種新型生物感測器，這種感測器能夠從其它大分子中識別特定的病毒物質。這些結果都被AFM圖像所證實。
生物分子間力譜曲線的觀測
對生物分子表面的各種相互作用力進行測量，是AFM的一個十分重要的功能。這對於了解生物分子的結構和物理特性是非常有意義的。因為這種作用力決定兩種分子的相互吸引或者排斥，接近或者離開，化學鍵的形成或者斷裂，生物分子立體構像的維持或者改變等等。在分子間作用力的支配下，還同時支配著生物體內的各種生理現象、生化現象、藥物藥理現象，以及離子通道的開放或關閉，受體與配體的結合或去結合，酶功能的激活或抑制等等。因此，生物分子間作用力的研究，在某種意義上說，就是對生命體功能活動中最根本原理的研究。這也為人們理解生命原理，提供了一個新的研究手段和工具。
將兩種分子分別固定於AFM的基底和探針尖端上。然後使帶有一種分子的探針尖端在垂直方向上不斷地接近和離開基底上的另一種分子。這時，兩種分子間的相互作用力，就是二者間的相對距離的函式。這種力與距離間的函式關係曲線，稱之為力譜曲線。
利用AFM獲得的力譜曲線在生物醫學中的套用：在探測一個細胞之後，根據所遇到的阻力，AFM就會賦予一個表明細胞柔軟度的數值。研究人員發現，儘管正常細胞的硬度各有不同，但癌細胞比正常細胞要柔軟得多，所研究的胰腺、肺部和乳腺細胞均是如此。一些腫瘤的細胞可能比另外一些更為堅硬，那就意味著這些腫瘤惡化轉移的可能性較小，對病人的威脅也較小。利用AFM還可以研究不同藥物對癌細胞的影響。針對細胞用藥後，AFM可以觀察在藥物的作用下細胞的變化情況。這樣可以開發出比當前所用的藥物毒性更小、但同樣能夠阻止正常細胞發生癌變的藥物，以免因癌症擴散而危及生命。
