概念
副粘病毒F蛋白HR1和HR2在特異性膜融合中的作用
目的了解副粘病毒融合蛋白（F）分子上的七肽重複序列（HR1、HR2）在特異性膜融合中的作用。方法採用基因定點突變方法，在新城疫病毒（NDV）F與人副流感病毒（hPIV）F基因上創造相同的酶切位點。酶切後採用基因重組方法將F的HR1基因片段相互交換，得到交換HR1的兩個嵌合體（chimera），即NDVC-HR1和hPIVC-HR1。用同樣的方法又得到交換HR2的兩個嵌合體。即NDVC-HR2和hPIVC-HR2。將各種嵌合體DNA與同源及異源HNDNA共轉染BHK21細胞後，在真核細胞中表達。Giemsa染色和指示基因法檢測細胞融合功能，螢光強度分析（FACS）檢測F蛋白的表達效率。結果交換HR1後，NDVC-HR1的融合功能只有野毒株的53．91％，hPIVC-HR1的融合功能達到野毒株的83．15％；交換HR2後，NDVC-HR2的融合功能略高於野毒株，達到野毒株的107．23％，hPIV C-HR2的融合功能卻只有野毒株的12．01％。FACS分析表明，交換HR1後的NDVC-HR1和hPIVC-HR1的表達效率均下降。交換HR2後，NDVC-HR2的表達效率沒有改變，而hPIVC-HR2的表達效率下降。結論NDVF的HR1對其特異性膜融合具有重要作用，而HR2則沒有病毒特異性；hPIVF的HR1和HR2對hPIV的特異性膜融合都有重要作用。
相關內容
副粘病毒融合蛋白分子上特異性細胞融合作用位點的初步確定
副粘病毒融合蛋白分子上特異性細胞融合作用位點的初步確定
中華微生物學和免疫學雜誌 2000年第4期第20卷 病毒學
單位：250012 濟南，山東醫科大學病毒學研究室
關鍵字：副粘病毒；融合蛋白；細胞融合；基因
【 摘要 】 目的 找到副粘病毒融合蛋白(F)分子上與血凝素-神經氨酸酶(HN)相互作用的特異性區域，弄清F融合細胞的分子機理。 方法 採用基因定點突變法，創造一個酶切位點，得到突變株，然後用基因重組的方法得到各種重組株，並於真核細胞內進行表達，Gimsa染色和指示基因法檢測細胞融合功能，螢光強度分析(FACS)檢測表達效率情況。 結果 在將各有關F基因片段進行交換之前，創造一個酶切位點時所得突變株的細胞融合功能與野毒株相同；將新城疫病毒(NDV) F和副流感病毒(PIV) F在膜穿入部分和軀幹部分交接處交換時，不影響細胞融合功能；進一步將F2進行交換時，也不影響細胞融合功能；而將F的頭部進行交換時，則檢測不到細胞融合作用，FACS分析表明，F沒有達到細胞表面。 結論 F分子上與HN相互作用的特異性區域位於膜穿入部分和軀幹部分交接處與F1和F2交接處之間，即F1除去膜穿入部分和尾部的剩餘部分。
Preliminary identification of an active domain on fusion protein of paramyxoviruses
WANG Zhiyu
（Department of Virology, Shandong Medical University, Ji′nan 250012, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To identify an active domain that interacts with homologous hemagglutinin-neuraminidase(HN) on fusion protein (F) of paramyxoviruses and to find the molecular mechanism of cell fusion. Methods Site-directed mutagenesis was used to get mutants by creating a new enzyme site and gene recombination was used to get chimeric F proteins. All the wild type, mutant and chimeric F proteins were expressed in eukaryocytes and their fusion functions were assayed by Gimsa staining and fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis. Results All the mutants with a new enzyme site have the same functions as wild type. When the two F genes were recombined at the site between transmembrane and stalk parts, the fusion functions of the chimeric proteins were not affected. Also, this function was not affected when the F′s were exchanged with F2. But fusion activity disappeared when the F′s were exchanged with head parts and F molecules did not reach cell surface as shown by FACS analysis. Conclusion The specific interaction domain with HN on F protein is in the whole stalk and part of head, i. e. in F1 except transmembrane and tail parts.
【 Subject words 】 Paramyxovirus; Fusion protein; Cell fusion; Gene
副粘病毒感染細胞的一個重要步驟是病毒包膜與靶細胞膜發生融合〔1〕。細胞融契約時也是副粘病毒感染細胞後產生的典型病理特徵〔2〕。這一過程由病毒包膜中的兩種糖蛋白共同來完成，即血凝素-神經氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase, HN)和融合蛋白(Fusion, F)來完成的〔3,4〕。HN能吸附於靶細胞，具有血吸附、神經氨酸酶(NA)活性和促進細胞融合作用；而F能破壞靶細胞膜，並引起融合。但F單獨表達並不能完成這一過程，需要和同源性HN共同表達才能顯示出融合細胞的活性，而和異源性HN共同表達時也不能引起細胞融合，說明F和HN的相互作用具有極強的特異性，它們之間存在著一種相互聯繫的區域，以產生信息的傳遞〔5，6〕。
本工作以新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和副流感病毒(Parainfluenza virus, PIV) 為模型來研究F分子上與HN相互作用的活性位點，因NDV F 和PIV F的同源性高達39%，採用基因定點突變和基因重組的方法，尋找F分子上與HN相互作用的位點，既科學又快速。
材料與方法
材料
（1）病毒：痘苗病毒野毒株和重組株vTF7-3由Moss教授提供，滴度分別為107 PFU/ml和109 PFU/ml，在BHK21細胞上培養傳代。
（2）細胞：BHK21細胞由美國AFCC公司提供，用Dubecco Eagle培養液培養傳代。實驗時每孔接種4×105，16h後使用。
（3）工具酶：各種內切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA連線酶等均由美國New England生物合成公司提供。
（4）質粒DNA及基因克隆：pBSK+質粒DNA和NDV、PIV基因克隆由Iorio博士惠贈。
方法
（1）質粒DNA轉染：感染病毒：選生長良好的細胞孔，每孔接種痘苗病毒野毒株25μl，用DMEM培養液稀釋，每孔接種0.3ml；另一系列感染痘苗病毒重組株，每6孔板接種量為25μl，即取原液25μl，用DMEM稀釋成1.8ml，每孔接種0.3ml。37℃吸附1h後，用DMEM培養液洗滌1次。轉染：取待轉染的質粒DNA 1μg，與12μl Dope混合，再加入88μl OptiMEM，混勻後加入100μl OptiMEM,室溫反應10min。置入相應已感染病毒的細胞孔內，37℃ 5h後，加入BHK21細胞培養液1ml。16h後檢測細胞融合情況。
（2）基因定點突變：引物設計：實驗用引物由美國Biosynthesis公司合成。引物 1: 5′AATGTCAAACTGGCTAGCACATCTGC 3′; 引物 2: 5′ATTGGCATCAAGCTAGCACCACA 3′; 引物 3: 5′
AAGGAGACAGAAGCGCTTTATAGGTGC 3′; 引物 4: 5′CCCCAGAACAAAGCGCTTCTTTGGAGG 3′; 引物 5: 5′CAGACCCCCATGGTATCATAT 3′; 引物 6: 5′ATGTACATGCAACGGTATCCATGGTAGAATCAATCAACCACCT 3′。各引物中新增加一個酶切位點，用於酶切反應挑選突變株和基因重組。突變反應：以單鏈含有F基因的質粒DNA為模板，加入上述已磷酸化的引物，加入T4 DNA聚合酶和T4 DNA連線酶，37℃反應2h後終止反應。
（3）細胞轉化：用CaCl2法將反應物轉化大腸桿菌MV1190。
（4）挑選突變株：從轉化的細菌菌落中隨機挑選若干進一步擴增，提取質粒DNA，酶切反應初步鑑別突變株，然後進行DNA序列分析，進一步確定突變株。
（5）DNA序列分析：採用雙脫氧末端法，按照BioRAD公司手冊提供的方法進行。
（6）基因重組：NDV F和PIV F由4個部分組成，即頭部、軀幹部、膜穿入部分和尾部（圖1）。按從兩端開始交換重組，逐步向內深入的思路，將NDV F 和PIV F需要交換的部分，用雙酶切反應法切下，然後進行相互交換（圖1），用連線酶連線，轉化細胞後，挑選重組株。
圖1 F蛋白嵌合體構建策略
Fig 1. Strategy for the construction of F chimeras
The division of the F proteins of NDV and hPIV3 into cytoplasmic tail, transmembrane anchor, and putative stalk and globular domains is shown with the amino acid residues that constitute each domain listed. Unique, homologous restriction sites were introduced into the NDV and hPIV3 F genes to make possible the construction of chimeras in which the cytoplasmic tails and transmembrane anchors(NheⅠ), F2(Eco47Ⅲ)or globular domains(NcoⅠ) were exchanged between the two proteins.
（7）DNA表達效率分析：轉染後的細胞用間接免疫螢光法檢測細胞表面F分子的表達量。第一抗體為F MCAB 1a、2b、3c的混合物；第二抗體為羊抗鼠螢光標IgG，用Becton Dickinson流式細胞儀分析細胞表面螢光強度(FACS)。
（8）Gimsa染色：將待測細胞孔的液體吸乾，每孔加入1ml甲醇，室溫固定3～5min。吸乾，乾燥後加入1∶20的Gimsa染液，染色15～20min。吸去染液，用蒸餾水洗滌後，於鏡下觀察、拍照記錄細胞融合情況。
（9）細胞融合定量分析：採用指示基因法。第一系列：感染vTF7-3重組痘苗病毒株於BHK21細胞，然後共轉染HN和F基因；第二系列：感染痘苗病毒野毒株於BHK21細胞，轉染pG1NT7-gal質粒DNA。16h後，用胰酶消化各孔細胞，離心洗滌後，懸浮於0.8ml BHK21細胞培養液。將兩系列細胞各0.1ml(105)，混勻後加入96孔平底培養板。37℃培養5h後，每孔加入10μl 10% NP-40，室溫搖擺震盪30min。取50μl上清與等量的濃度為16mmol/L的氯酚紅-D-半乳糖吡喃糖苷(CPRG)混合，室溫反應20min後用Softmax軟體支持下的ELISA檢測儀，於570nm波長下自動讀數。以載體質粒DNA為背景作為陰性對照。
結果
1.NDV F T496A和PIV F S490A突變株的建立及其功能：以引物1和引物2進行定點突變反應，轉化MV1190後得到NDV F T496A和PIV F S490A兩種突變株，經細胞融合功能觀察，與野毒株無差別（圖2）。可用於酶切反應，進行基因重組。
參考文獻
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