1850年井伊直弼的義父直亮死後，繼承彥根藩主的職位，後兼任幕府大老。此時日本民族危機嚴重，以美國為始的西方列強逼迫日本開國，日本統治階級無計可施。
正當此時(1853年6月22日)，將軍德川家慶去世，其第四子家祥(改名家定)繼承將軍職位，時年30歲。但家定自幼思癲癇病，資質平凡，缺乏威嚴，不能總理國政，因此將軍繼嗣問題便成了一件大事。某些公卿選擇繼承人——紀州家的慶福和一橋家的慶喜。慶福和將軍家定還是堂兄弟關係，血統很近，但他生於弘化三年(1846)，當時還不滿十歲，如輔佐將軍感到年齡尚幼。慶喜則是水戶藩德川齊昭的第七子，天保八年(1837)生，比慶福大十歲，資質聰明，受到齊昭寵愛。
在上述開國和將軍繼嗣這兩個問題上，井伊直弼和德川齊昭發生尖銳的矛盾。水戶藩主德川齊昭在直弼提出意見書的一個月以前(1853年7月10日)，以十條五事的理由提出強硬的主戰論(即攘夷論)，它和直弼的“不可開無謀之兵端以亡人壽”的非戰論發生尖銳的矛盾。這個矛盾在次年(1654)1月16日培理再次來日本時爆發。那時齊昭主張振興土氣，同心協力打退外敵，直弼及掘田正睦則反對，主張和平穩妥論，對齊昭發起的“毀鍾鑄炮”的太政官命令大為不滿。
在另一個繼嗣問題上，安政五年(1858)1月老中掘田正睦為奏請天皇批准日美修好通商條約而往京都的前後，將軍繼嗣問題開始激化，成為動搖政局的重大問題。直弼站在“血統尊重論”的立場上堅決主張擁立紀州家的慶福為將軍嗣子，齊昭則站在國家利益上堅決主張擁立一橋家的慶喜。他們兩人的矛盾還表現在幕閣
的派系鬥爭上。安政三年(1856)老中阿部正弘病死(39歲)，齊昭喪失了幕閣內唯一的支持者，於是被迫辭職，免除參與幕政。接著掘田正睦和松乎忠固的聯合幕閣成立，明確打起反水戶藩的旗幟，排除齊昭一派的勢力，而掘田、松平聯合幕閣的總後台則是井伊直粥。從此以後，直弼左右外交問題及將軍繼嗣問題，成了政界的中心人物。
老中掘田正睦到京都奏請天皇批准日美修好通商條約，而朝廷下令不批，於是不得不回到江戶。從此以後他的思想發生轉變，開始傾向一橋派。同時一橋派的主將松乎慶永參與幕政，這對一橋派有利。此時掘田又宣布天皇不準條約，增加了一橋派必勝的信心。
然而，安政五年(1858)4月23日，直弼在紀州派的支持下就任大老，這對一橋派簡直是個晴天霹雷。直弼就任大老以後，立即作出決定，違救在日美修好通商條約上籤字。直弼認為，與其拒絕簽訂條約使國體受辱，不如不等效許擅自簽字可全國體，在海防軍備不足的情況下，決心一身甘受重罪而保全大局。於是同年6月19日由下田奉行井上清直在美艦上正式簽訂日美修好通商條約。21日由掘田正睦、松乎忠因、久世廣周、內藤信親、脅阪安宅五老中聯名上疏，說明因形勢所迫而簽訂，如失去機宜，英法艦隊開來，有重蹈“鄰國(指中國)覆轍之虞”，不等救許是隨機應變的處置。條約一簽訂，直弼就罷免傾向一橋派的掘田正睦和松平忠固，改組幕閣，強化內部。
關於將軍繼嗣問題，直兩決定從血統內選擇，並奏請朝廷救許。同年6月25日，正式公布紀州慶福為將軍的嗣子。
以上兩個重大問題的決定，使一橋派感到巨大的悲憤。特別齊昭和水戶慶駕、尾州慶恕一起當面指責違救之罪，直弼懷恨在心，決定施展陰謀剪除德川齊昭等反對派。正當此時(即1858年7月6日)，將軍家定突然死去(謠傳被一橋派毒死)，幕府便乘機報復，處罰德川齊昭等人，即命令德川齊昭閉門反省，禁止通信；德川慶駕和一橋慶喜停止登城參政；德川慶恕隱退；松平慶水反省。與此同時，老中間部拴勝親自到京都，密謀逮捕水戶藩的志士鵜飼吉左衛門及其子鵜飼幸吉。接著，由於鵜飼吉左衛門的除奸計畫敗露，又大批捕捉水戶藩志士及朝廷貴族的家臣達40多人。
同時在江戶也進行大逮捕，被捕的有堂上人(貴族)的家臣飯泉善內、薩州藩士下部伊三次、儒家藤森大雅、越前藩士橋本左內。大逮捕不但在京都、江戶進行，還波及地方。在薩州有僧月照和西鄉吉之助(即西鄉隆盛，末死)的投梅自殺，在長州有吉田松陰。後來又逮捕了水戶藩主的助手——安島帶刀、茅根伊予之介和觸澤伊太夫。幕府對逮捕的人分別審訊定罪；安島帶刀切腹，茅根伊予之介、鵜飼吉左衛門及其子幸吉、橋本左內、賴三樹三郎、吉田松陰、飯泉善內斬首，其他或流放或關押，這就是所謂安政大獄。
由於直弼大老和間部閣老的高壓手段，朝廷內九條關白復職，並奏請天皇宣布家茂(即慶福)為將軍。
安政大獄發生以後，越發激起反對派(尊王攘夷派)的憤怒，使以前未成熟的除奸計畫具體化，最後促成行刺大老井伊直死的壯舉。志士高橋多一郎、金子孫二郎、關鐵之介等水戶藩激進派領袖先後潛人江戶，準備先殺死井伊直弼，再燒掉橫濱外國人的商館，然後等待薩摩藩3000人馬進京，東西呼應，一舉推翻幕府。於是參加除奸計畫的志士陸續趕到江戶。
萬延元年(1860)3月1日，金子孫二郎、木村權之衛門、齋藤監物、稻田重藏、佐藤鐵三郎、關鐵之介和有村雄助等，在日本橋西岸的“一料亭”匯合，商議行刺井伊直死的方案。即乘3月3日的上巳住節井伊大老在櫻田門外登城時襲擊，以四五人為一組，靠近大老的隊伍，先使先頭隊伍混亂而迫近大老，然後下手，誓必取其首級。行刺時如受重傷即自殺，或到老中家自首，其他人全部浴行京都，在當地參加義舉。晚上，關鐵之介、木村權之衛門、野村伊之介、佐野竹之介等19個同志在品川的酒樓“相模屋”設宴訣別。
此時井伊家的近衛家臣已有充分的戒心，矢田藩主松平信和到外櫻田邱宅拜見直弼，評述水戶藩的形勢，勸告立即辭去大老職務，否則命難保。直弼謝絕他的忠告，深深感到迫於國家形勢，不能計較個人安危，便回答說：“人各有天命，刺客果要殺我，縱然如何戒心也有隙可乘。”松平信和最後告誡要增加衛士，但直弼沒有如此做，因為衛士的人數是幕府規定的，不能隨便增加。
萬延元年(1860)3月3日那天，從早晨起就下雪了，這在春季是少有的天氣。今天井伊直弼登城是為了陳述上巳佳節的祝賀詞。上午9點，直弼在60多人的武裝部隊的保護下，從外櫻田的職宅 出發，當隊伍經過外櫻田門外的桿築藩邱門前的時候，突然有一群人攔轎告狀。其中有一人拿著訴狀，供頭日下部三郎右衛門和供目付澤村軍六正要接近拿狀紙的人，不料日下部三郎右衛門額上中了一刀倒下，澤村也戰死。在此稍前，另外一群志士襲擊槍付加田九郎太，要想奪槍。衛士們因前衛被襲，要想離開轎子上前防衛。正在此時，一聲槍響，一大群人從道路兩邊一齊向轎子衝過來，供目付何西忠左衛門奮戰而死，其他衛土有的受傷有的逃走。
有一名志士乘轎邊無人阻擋，揮刀向轎中刺去，接著就打開轎門將大老直弼拖出來，一刀取下首級，疾呼一聲，向日比谷門而去。此時小河原秀之遠負傷昏倒在地，被志士的呼聲喚醒，發覺主君的首級已被取去，立即追上前去。追至長州藩邱前面，從背後向那志士砍去，將他砍傷，自己卻被那志士返身過來再次砍倒。原來取下直弼首級的是薩州脫藩志士有村次左衛門，他被小河原砍中以後傷勢甚重，自知命難保，在辰之口的若年寄遠藤風統邸宅前放下直弼的首級，切腹而死。據一般說法，打手槍的是現場總指揮關鐵之介。
這次事件史稱“櫻田門外之變”，井伊家的衛士被當場打死的有河西忠左衛門、澤村軍六、加田九郎太、水田太郎兵衛四人，重傷後死的有日下部三郎右衛門、小河原秀之遠、岩崎德之進、越石源次郎四人，其他負傷的有十多人。
參加行刺大老的志土有水戶藩脫藩士關鐵之介、稻田重藏、山口辰之介、鯉淵要人；廣岡子之次郎、黑澤忠三郎、佐野竹之介、杉山孫一郎、岡部三十部、廣木松之介、增子金八、齋藤監物、蓮田市五郎、森五六郎、森山繁之介、大關和七郎、海後磋礬之介，以及薩州藩的有村次左衛門，共18人。
三月晦日，免去直弼的大老職務。閏三月晦日，井伊家發喪。4月9日從外櫻田的井伊邸宅出棺，10月葬於茬原郡世田谷村的菩提寺豪德院，說號為宗觀院柳曉覺翁。
