概述
動物受到病毒感染後，體內產生特異性中和抗體，並與相應的病毒粒子呈現特異性結合，因而阻止病毒對敏感細胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。
中和試驗 (Neutralization Test)是以測定病毒的感染力為基礎，以比較病毒受免疫血清中和後的殘存感染力為依據，來判定免疫血清中和病毒的能力。
兩種試驗方法介紹
中和試驗常用的有兩種方法：一種是固定病毒量與等量系列倍比稀釋的血清混合，另一種是固定血清用量與等量系列對數稀釋(即十倍遞次稀釋)的病毒混合。
(一) 定血清－稀釋病毒法(病毒中和試驗)
1.病毒毒價的測定 毒價單位：衡量病毒毒價(毒力)的單位過去多用最小致死量(MLD)，即經規定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內能致全組試驗動物死亡的最小劑量。但由於劑量的遞增與死亡率遞增不呈線性關係，在越接近100%死亡時，對劑量的遞增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%時，對劑量的變化越敏感，故現多改用半數致死量(LD50)作為毒價測定單位，即經規定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內能致半數試驗動物死亡的劑量。用雞胚測定時，毒價單位為雞胚半數致死量(ELD50)或雞胚半數感染量 (EID50)。用細胞培養測定時，用組織細胞半數感染量(TCID50)。在測定疫苗的免疫性能時，則用半數免疫量(IMD50)或半數保護量(PD50)。
(1) LD50的測定(以流行性乙型腦炎病毒為例)。
測定方法：將接種病毒，並已發病瀕死的小鼠，無菌法取腦組織，稱重、加稀釋液充分研磨，配製成10-1懸液，3 000r/min離心20分鐘，取上清液，以10倍遞次稀釋成10、10、10……10，每個稀釋度分別接種5隻小鼠，每隻腦內注射0.03ml，逐日觀察記錄各組的死亡數。
| 表2-24 LD50的計算（接種劑量為0.03ml） | |||||||
| 病毒稀釋度 | 接種鼠數 | 活鼠數 | 死鼠數 | 積累總計 | 死亡比 | 死亡率(%) | |
| 活鼠 | 死亡 | ||||||
| 10 | 5 | 0 | 5 | 0 | 15 | 15/15 | 100 |
| 10 | 5 | 0 | 5 | 0 | 10 | 10/10 | 100 |
| 10 | 5 | 1 | 4 | 1 | 5 | 5/6 | 83 |
| 10 | 5 | 4 | 1 | 5 | 1 | 1/6 | 17 |
| 10 | 5 | 5 | 0 | 10 | 0 | 0/10 | 0 |
| 10 | 5 | 5 | 0 | 15 | 0 | 0/15 | 0 |
高於50%的死亡分數-50% 83%-50%
距離比例= ──────────────────── = ────── = 0.5
高於50%的死亡百分數-低於50%的死亡百分數 83%－17%
LD50的對數=高於50%病毒稀釋度的對數+距離比例×稀釋係數的對數
本例高於50%病毒稀釋度的對數－6，距離比例為0.5，稱釋係數的對數為－1。代入上式：
LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5
則LD50=10，0.03ml，即該病毒作10稀釋，接種0.03ml能使半數小鼠發生死亡。
注意：稀釋血清法中和試驗，計算TCID50或LD50，MID50時，計算公式應改為：TCID50的對數=高於50%血清稀釋度的對數－距離比例×稀釋係數的對數。
如按Karber氏法計算，其公式為：
IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)
L為病毒最低稀釋度的對數，d為組距，即稀釋係數，S為死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3
IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5)
=－6.5
則 LD50=10，0.03ml
注意：用本法計算稀釋血清中和試驗中和效價時，S應為保護比值之和。
(2)EID50的測定（以新城疫病毒為例） 將新鮮病毒液體10倍遞次稀釋法釋成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀釋度，分別接種9-10日齡雞胚尿囊腔，雞胚必須來自健康母雞，並且沒有新城疫抗體。每隻雞胚接種0.2ml，每個稀釋度接種6隻雞胚為一組，以石蠟封口，置37-38℃培養，每天照蛋，24h之內死亡的雞胚棄掉，24h之後死亡的雞胚置4℃保存。連續培養5天，取尿囊液作血球凝集試驗，出現血凝者判陽性，記錄結果，按上述方法計算 EID50。
(3) TCID50的測定（以致細胞病變病毒為例） 取新鮮病毒懸液，以10倍遞次稀釋成不同稀釋度，每個稀釋度分別接種經Hank’s液洗3次的組織細胞管，每管細胞接種0.2ml，每個稀釋度接種4隻細胞管，接種病毒後的細胞管放在細胞盤內，細胞層一側在下，使病毒與細胞充分接觸，放置37℃吸附1h，加入維持液，置37℃培養，逐日觀察並記錄細胞病毒管數，按上述方法計算TCID50。
2.中和試驗
(1) 病毒稀釋度的選擇 選擇病毒稀釋度範圍，要根據毒價測定的結果而定，如病毒的毒價為10，則試驗組選用10－10對照組選用10－10其原則是：最高稀釋度要求動物全存活（或無細胞病變），最低稀釋度動物全死亡（或均出現細胞病變）。
(2)血清處理 用於試驗的所有血清在用前須作56℃30min加溫滅活。但來自不同動物的血清，滅活的溫度和時間也是不同的。
(3)病毒的稀釋 按選定的病毒稀釋度範圍，將病毒液作10倍遞次稀釋，使之成為所需要的稀釋度。
(4）感作 將不同稀釋度病毒分別定量加入兩排無菌試管內，第一排每管加入與病毒等量的免疫（或被檢）血清作為試驗組；第二排每管加入與免疫（或被檢）血清同種的正常陰性血清作為對照組；充分搖勻後放37℃感作12h。
(5) 接種 按“病毒價測定”中所述接種方法接種試驗動物（或雞胚、組織細胞）。觀察持續時間，根據病毒和接種途徑而定。
(6)中和指數據計算 物按Reed和Muench兩氏法（或Karber）法分別計算試驗組和對照組的LD50（或EID50、TCID50）
試驗級LD50 (EID50、TCID50)
中和指數= ──────────────────
對照組LD50 (EID50、TCID50)
假如試驗組LD50為10，對照組LD50為10。則中和指數為10，10=1 995，也就是說該待檢血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。
(7)結果判定 固定血清―稀釋病毒法進行中和試驗，當中和指數大於50，表示補檢血清中有中和抗體；中和指數在10-50為可疑；若中和指數小於10為無中和抗體存在。(二) 固定病毒-稀釋血清法
（血清中和試驗）
1.病毒毒價的測定（微量法）
(1) 病毒的製備 將病毒接種於單層細胞，37℃吸附1h後加入維持液，置溫箱培養；逐日觀察，待細胞病變（CPE）達75%以上，收穫病毒懸液凍融或超音波處理，以3 000r/min離心10min，取上清液，定量分裝成1ml小瓶置-70℃保存備用，選用的病毒必須是對細胞有較穩定的致病力。
(2) 病毒毒價測定 取置-70℃冰櫃保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養板上作10倍遞進稀釋即10，10，10……，每孔病毒懸液量為50μl，每個稀釋度作8孔，每孔加入100細胞懸液，每塊板的最後一行設8孔細胞對照，製備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5%CO2溫箱37℃培養，從48-14h逐日觀察細胞病變，記錄結果。
按Reed和Muench兩氏法計算TCID50。
56%-50%
距離比例= ────────
56%-33%
本例高於50%病毒稀釋度的對數為－6，距離比例為0.26，稀釋係數的對數為－1。
| 表2-25 TCID50計算（接種劑量50μl） | |||||||
| 病毒稀釋度 | 接種數 | CPE數 | 無CPE數 | 累 計 | CPE率 | 百分數(%) | |
| CPE | 無CPE | ||||||
| 10 | 8 | 8 | 0 | 39 | 0 | 39/39 | 100 |
| 10 | 8 | 8 | 0 | 31 | 0 | 31/31 | 100 |
| 10 | 8 | 7 | 1 | 23 | 1 | 23/24 | 96 |
| 10 | 8 | 5 | 3 | 15 | 4 | 15/19 | 79 |
| 10 | 8 | 4 | 4 | 10 | 8 | 10/18 | 56 |
| 10 | 8 | 4 | 4 | 6 | 12 | 6/18 | 33 |
| 10 | 8 | 2 | 6 | 2 | 18 | 2/20 | 10 |
| 10 | 8 | 0 | 8 | 0 | 26 | 0/26 | 0 |
= －6.3
則TCID50=10，50即病毒作10稀釋，每孔接種50μl，可使半數組織細胞管發生病變。
2.中和試驗
(1) 血清的處理 動物血清中，含有多種蛋白質成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素，用於中和試驗的血清須經加熱滅活處理。各種不同來源的血清，須採用不同溫度處理，豬、牛、猴、貓及小鼠血清為60℃；水牛、狗及地鼠血清為62℃；馬兔血清為65℃；人和豚鼠血清為56℃。加熱時間為20-30min，60℃以上加熱時，為防止蛋白質凝固，應先以生理鹽水作適當稀釋。
(2) 稀釋血清 取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養板上，用稀釋液作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量為50μl，每個稀釋度作4孔。
(3) 病毒 取－70℃冰櫃保存的病毒液，按經測定的毒價作200TCID50稀釋（與等量血清混合，其毒價為100TCID50）。如本例病毒價為10，50μl。所以應將病毒作2×10稀釋。
(4) 感作 每孔加入50μl病毒液，封好蓋，置於37℃溫箱中和1h。
病毒與血清混合，0℃下，不發生中反應，4℃以上中和反應即可發生。常規採用37℃作用1h，一般病毒都可發生充分的中和反應。但對易於滅活的病毒可置4℃冰櫃感作，根據不同耐熱性的病毒感作溫度和時間應有所不同。
(5) 加入細胞懸液 在製備細胞懸液時，其濃度以在24h內長滿單層為度：血清病毒中和1h後取出，每孔加入100μl細胞懸液。置5%CO237℃溫箱培養，自培養48h開始逐日觀察記錄，14h終判。
由於各種病毒引起細胞病變時間不同，終判時間應根據病毒致細胞病變的快慢而定。
(6) 設立對照 為保證試驗結果的準確性，每次試驗都必須設定下列對照，特別是在初次進行該種病毒的中和試驗時，尤為重要。
陽性和陰性血清對照：陽性和陰性血清與待檢血清進行平行試驗，陽性血清對照應不出現細胞病變，而陰性血清對照應出現細胞病變。
病毒回歸試驗：每次試驗每一塊板上都設立病毒對照相，先將病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加50μl。然後每孔100μl細胞懸液。 0.1TCID TCID50應不引起細胞病變，而且100TCID TCID50必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。
血清毒性對照相：為檢查被檢血清本身對細胞有無任何毒性作用，設立被檢血清毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢血清（相當於中和試驗中被檢血清的最低稀釋度）。
正常細胞對照相：即不接種病毒和待檢血清的細胞懸液孔。正常細胞對照應在整箇中和試驗中一直保持良好的形態和生活特徵，為避免培養板本身引起試驗誤差，應在每塊板上都設立這一對照。
(7) 結果判定和計算 當病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細胞對照相，血清毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢血清孔出現100%CPE判為陰性，50%以上細胞出現保護者為陽性；固定病毒稀釋血清中和試驗的結果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產生細胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。
用Reed和Muench兩氏法（或Karber法）計算結果，如表2-26
80%－50%
距離比例= ────── =0.5
80%－20%
Ig TCID50=高於50%血清稀釋度的對數－距離比例×稀釋係數的對數
Ig TCID50=－1.5－0.5×（－0.3）=－1.35
| 表2-26 固定病毒－稀釋血清法中和抗體效價計算 | |||||||
| 血清稀釋 | CPE數總孔數 | CPE數 | 無CPE數 | 積累 | CPE比率 | 百分數 | |
| CPE | 無CPE | ||||||
| 1:4(10) | 0/4 | 0 | 4 | 0 | 12 | 0/12 | 0 |
| 1:8(10) | 0/4 | 0 | 4 | 0 | 8 | 0/8 | 0 |
| 1:16(10) | 1/4 | 1 | 3 | 1 | 4 | 1/5 | 20 |
| 1:32(10) | 3/4 | 3 | 1 | 4 | 1 | 4/5 | 80 |
| 1:64(10) | 4/4 | 4 | 0 | 8 | 0 | 8/8 | 100 |
因10=1/22，即1:22的血清可保護50%細胞不產生病變，1:22就是該份血清的中和抗體效價。
影響中和試驗的因素：
(1) 病毒毒價的準確性是中和試驗成敗的關鍵，毒價過高易出現假陰性能，過低會出現假陽性。在微量血清中和試驗中，一般使用100-500 TCID50。
(2) 用於試驗的陽性血清規戒律，必須是用標準病毒接種易感動物製備的。
(3) 細胞量度的多少與試驗有密切關係，細胞量過大或過小易造成判斷上的錯誤，一般以在24h，內形成單層為宜。
(4) 毒價測定的判定時間應與正式試驗的判定時間相符。
試驗套用
1.病毒株的種型鑑定：中和試驗具有較高的特異性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清，即可測知相應血清或病毒的型，所以，中和試驗不但可以定屬而且可以定型。
2.測定血清抗體效價：中和抗體出現於病毒感染的較早期，在體內的維持時間較長。動物體內中和抗體水平的高低，可顯示動物抵抗病毒的能力。
3.分析病毒的抗原性：毒素和抗毒素亦可進行中和試驗，其方法與病毒中和試驗基本相同。
用組織細胞進行中和試驗，有常量法和微量法兩種，因微量法簡便，結果易於判定，適於作大批量試驗，所以近來得到了廣泛的套用。
