基本信息
組成: 50 mMTris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40,
0.1% SDS.(配有一支PMSF).使用RIPA裂解達到的蛋白樣品,可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由於含有較高濃度的去污劑,不能用Bradford法測定RIPA裂解後的蛋白濃度。
保存: 4℃;避光
成分
RIPA裂解液(強)的主要成分為50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1%TritonX-100,1% sodium deoxycholate,0.1% SDS,以及2mM sodium pyrophosphate,25mM β-glycerophosphate,1mM EDTA,1mM Na3VO4,0.5 ug/ml leupeptin等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白降解。
RIPA裂解液(中)的主要成分為50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1% NP-40,0.5% sodium deoxycholate。
使用方法
對於培養細胞樣品:
1. 融解RIPA裂解液,混勻。取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM。
2. 對於貼壁細胞:去除培養液,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒後,細胞就會被裂解。
對於懸浮細胞:離心收集細胞,用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解後應沒有明顯的細胞沉澱。如果細胞量較多,必需分裝成50-100萬細胞/管,然後再裂解。
裂解液用量說明:通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。
對於組織樣品:
1. 把組織剪下成細小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液,混勻。取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)
4. 用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。
5. 充分裂解後,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。
6. 如果組織樣品本身非常細小,可以適當剪下後直接加入裂解液裂解,通過強烈vortex使樣品裂解充分。然後同樣離心取上清,用於後續實驗。直接裂解的優點是比較方便,不必使用勻漿器,缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
註:RIPA裂解液的裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物,屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組
DNA等的複合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用於後續實驗;如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨後離心取上清用於後續實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子,例如NFκB、p53等時,通常不必進行超聲處理,就可以檢測到這些轉錄因子。
用途
產品名稱 | Western及IP細胞裂解液 | RIPA裂解液(強) | RIPA裂解液(中) | RIPA裂解液(弱) | NP-40裂解液 | SDS裂解液 |
有效裂解成分 | 1% Triton X-100 | 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% NP-40, 0.5% deoxycholate | 1% NP-40, 0.25% deoxycholate | 1% NP-40 | 1% SDS |
裂解強度 | 溫和 | 強 | 中 | 溫和 | 溫和 | 強 |
對膜蛋白的提取 | 一般 | 很好 | 較好 | 一般 | 一般 | 很好 |
對胞漿蛋白的提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
對核蛋白的提取 | 較好 | 很好 | 較好 | 較好 | 較好 | 很好 |
胞漿磷酸化蛋白提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
細胞核轉錄因子提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
含蛋白酶抑制劑 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
含磷酸酯酶抑制劑 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
主要用途 | WB, IP,co-IP | WB, IP | WB, IP | WB, IP, co-IP | WB, IP,co-IP | WB, ChIP |