Realtime PCR

所謂Real-Time PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用螢光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。real-time PCR技術即實時螢光定量PCR避免了傳統PCR以終產物監測定量產生的偏差，提高實驗的重複性。該技術已經被廣泛用於監測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因晶片，siRNA干擾的實驗結果。

操作流程

Realtime PCR

1 收集樣品

2 相關試劑　總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV（cDNA逆轉錄酶）, RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix （螢光定量PCR預混試劑）。

3 實驗儀器 螢光定量PCR儀; PCR儀；低溫離心機。

4 總RNA提取

5 cDNA合成　在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA（1µg/µl）； 2µl隨機引物（T18, 10pmol/ul）；2µl 10mM dNTP mix；加水至15µl體系。混勻後70℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer；1µl RNaseout；1µl M-MLV RT；加水至30µl體系。PCR儀中反應條件設定 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應。合成好的cDNA置於 -20 ℃保存備用。

thermal cycler protocol

6 引物設計與合成

引物需要管家基因引物與目標基因引物。

7 實時定量PCR 　按以下反應體系進行: 2x RealqPCR MasterMix（Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP）25ul；上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul；cDNA template 2ul。定量PCR儀擴增反應條件設定：50 ℃ 2min ；95 ℃ 10min ；95℃ 15s --60 ℃ 60 s （40個循環）。

8 PCR產物溶解曲線分析　 將所擴增的PCR 產物進行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴增產物單一，無非特異性擴增產物。溶解曲線生成的反應程式為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。

9 數據分析軟體對數據進行處理分析。

主要套用

1. DNA 或RNA 的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等；

2. 基因表達差異分析：例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 晶片或差顯結果的確證；

3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等。

常用方法

Realtime PCR 常用的兩種方法分別為Sybr green（螢光染料摻入法）和Taqman probe （探針法）。

螢光染料摻入法:

在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

此方法適用於：

1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上

2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。

3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。

4、高通量大規模的定量PCR檢測

5、專一性要求不高的定量PCR檢測。

探針法:

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步

此方法適用於：

1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩定重複性好，特異性更高。

2、適用於擴增序列專一的體系的檢測。

3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。

4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣最佳化引物設計條件都不能解決。

5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。

6、廣泛用於人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產品的檢驗檢疫,生物製品的鑑定。