簡介
局部粘著斑激酶
腫瘤細胞的侵襲性生長是一個多步驟的複雜過程，有多種生物化學因子參與其中。腫瘤細胞必須黏附於細胞外基質，通過促進依賴於PTK激酶活性的細胞外基質信號轉導，進而影響細胞的黏附、運動與遷移。局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）介導的信號轉導系統就是其中最為重要的細胞信號轉導途徑之一。因此在理論上阻斷FAK的表達就有可能幹擾細胞外基質對腫瘤細胞侵襲性生長的調控，進而達到抑制腫瘤細胞侵襲轉移發生的目的。
內容
FAK在腫瘤向惡性侵襲表型演進的過程中起著重要的作用，其與腫瘤侵襲轉移的高度相關性已在一些研究中得到證實【1】，因此以FAK為線索探討信號轉導通路阻斷與肝癌侵襲轉移間的關係將為進一步闡明肝癌侵襲轉移的分子機制，探索提高肝癌防治效果的方法及途徑提供有價值的理論指導。
研究發現FAK表達或活性阻斷使細胞增殖受到顯著抑制，這種抑制主要體現在G2/M期細胞比率的增加及S期細胞比率的下降。G2/M期是細胞周期的一個重要的調控點，是S期細胞完成了遺傳物質的複製準備進入有絲分裂期的階段，G2/M期的阻滯將使細胞進入M期減少，從而抑制細胞的增殖。除在G2/M期受阻外，對FAK表達的干預使Bel 7402肝癌細胞株在G0/G1期的比例也有所增加，雖然這種增加不如G2/M期增加明顯，但也表明對FAK的干預還有可能通過干擾細胞向S期過渡，進而抑制細胞的過度增生。
研究還發現FAK表達的阻斷使細胞凋亡的發生顯著增加，反義轉染組細胞凋亡發生率是對照組的15倍，差異非常明顯。對細胞凋亡的這種促進作用在細胞周期檢測中也同樣得到了證實，在相應的細胞周期圖上均可觀察到顯著的細胞凋亡峰。說明FAK在細胞凋亡的發生、發展過程中同樣發揮著重要的作用，FAK表達阻斷能夠顯著促進細胞凋亡的發生。
粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是整合蛋白介導的信號轉導中的重要成員,有酪氨酸蛋白激酶活性,並可自身磷酸化；具有類似FAK作用的FAK家族新成員不斷發現。新近發現FAK可抑制細胞凋亡,FAK本身是胱冬肽酶(caspase)的底物。作為信號分子的FAK,還與細胞內其他信號轉導通路存在串話(crosstalk),直接參與了細胞多種功能的調節。
近代細胞生物學的發展,早已認識到細胞粘附不單純是機械連線,但它所涉及的複雜信號轉導近十年才有所了解。在研究細胞表面粘附分子種類、結構及可能作用的基礎上,探討這些粘附分子所介導的信號轉導過程已成為信息傳遞領域的新熱點。整合蛋白(integrin)是廣泛存在於各種哺乳類動物細胞的主要粘附分子之一,它引起細胞與基質成分粘附而介導的信號轉導,特別是胞內第一個信號分子——粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的研究倍受重視,現已初步了解整合蛋白介導信號轉導的主要信號分子及其網路結構,特別是FAK的分子結構。
FAK本身是一個分子量為125kD的酪氨酸激酶,它缺乏跨膜區,似乎是一個純粹的細胞質酪氨酸激酶,但又不含胞質酪氨酸激酶和其他生長因子受體作用蛋白質常有的SH2和SH3結構域,可見FAK結構之特殊性,其歸類還懸而未決。已發現FAK分子中397和925位的酪氨酸殘基可被磷酸化,其活性隨整合蛋白在細胞膜表面聚集而升高。這種整合蛋白誘導的FAK磷酸化主要依靠β亞基的胞內結構域,也即整合蛋白成簇排列後,其β亞基胞內結構域的信息使FAK激活。此外,瞬間Ca離子濃度升高及PKC活性升高也可協助促成FAK磷酸化而活化。FAK鄰近C端有一序列能與聚焦粘附部位趨近,稱聚焦粘附靶標(focal adhesion targeting,FAT)序列,樁蛋白(paxillin)也與FAK中C端的一個序列結合。而在體外實驗中FAK鄰近N端的序列可與數種整合蛋白β亞基胞內結構域的人工合成肽結合。這些結合都使FAK分子與聚焦粘附部位接近。然後FAK分子中磷酸化酪氨酸位點與含SH2結構域(即Src同源序列2,能專一地與蛋白質中含磷酸酪氨酸的模體結合)的胞內蛋白質結合。通過這些複雜的相互作用,以FAK為中心的整合蛋白介導信號轉導得以起始。
FAK和細胞凋亡
儘管FAK的確切功能尚不清楚,但若干實驗均提示FAK可能有兩個作用,一是在細胞鋪展和移動時,FAK參與粘著斑形成和調節；二是FAK參與信號轉導過程,以告知細胞核其細胞已錨定了。近年有關FAK在細胞凋亡中的作用也業已肯定。
細胞粘附阻止凋亡，細胞凋亡時出現諸如細胞皺縮、染色質固縮並產生細胞與胞外基質(ECM)或細胞間粘附的解離等生物學特性變化,同樣破壞ECM、減少細胞表面粘附分子或解除細胞粘附,都可引起不同程度細胞凋亡,這被稱為失巢凋亡(anoikis),充分說明細胞粘附可阻止細胞凋亡。可見許多細胞生物學特性的呈現是以細胞錨定依賴(anchorage dependent)為基礎的。我們觀察到,將整合蛋白α5β1基因轉染至人肝癌細胞,使其過量表達,結果較對照組細胞更易發生凋亡。這說明錨定依賴增強的細胞,若失去粘附,其凋亡也加速。
FAK參與抑制細胞凋亡，人們發現多種腫瘤細胞中FAK活性顯著增加。這種FAK活性上升是否與腫瘤細胞凋亡受阻有關，引起了關注。去除細胞粘附可間接抑制FAK活性,進而誘導細胞凋亡。最近套用阻斷FAK參與粘著斑作用方法,直接證明了FAK參與抑制細胞凋亡。按FAK分子中一段能與整合蛋白β1亞基C端結合的順序,人工合成一個競爭性多肽,或製備抗FAK分子中粘著斑靶標(focal adhesion targeting,FAT)序列的單抗,分別將二者用微注射技術引入成纖維細胞,即競爭性多肽占領整合蛋白β1亞基C端,FAK不能參與下游信號轉導,最終都導致細胞凋亡。這說明即使細胞發生粘附,粘著斑也存在，只要胞內FAK功能被阻斷,細胞同樣發生凋亡。此外用轉染技術使細胞過表達FAK,也直接證明了FAK可抑制細胞凋亡。總之,細胞錨定依賴是細胞生存並逃逸凋亡的條件之一,其中包括細胞粘附、粘著斑形成、FAK激活、FAK下游信號進一步轉導直至細胞核等一系列複雜過程,因此設法抑制腫瘤細胞FAK活性,將是治療腫瘤的又一新探索途徑。
FAK與胱冬肽酶(caspase)，眾所周知,細胞凋亡是一個主動的、細胞本身所固有的死亡現象,涉及許多基因的表達和激活一系列的蛋白水解酶即胱冬肽酶(caspase),瓦解細胞成凋亡小體,最終被吞噬細胞吞噬。目前確認的胱冬肽酶底物有DFF蛋白、Bcl2、Rb蛋白等。最近發現FAK也是胱冬肽酶底物。用TNF-α家族成員Fas或Apo-2L誘導T細胞和肺癌細胞凋亡時,發現活化的胱冬肽酶可水解FAK。Apo-2L誘導T細胞凋亡2h時,FAK即被水解釋放出85kD的FAK片段,4h釋放出77kD的FAK片段,24h時85kD片段消失,77kD仍存在,此種FAK的水解可被半胱氨酸蛋白酶抑制劑阻遏。在體外,進一步觀察到FAK對各種胱冬肽酶的敏感性是不同的。胱冬肽酶3和7能水解FAK並產生85kD片段但不產生77kD片段；而胱冬肽酶6僅能水解FAK產生77kD。所以在凋亡的不同時相,多種胱冬肽酶作用於FAK,以去除FAK抑制凋亡的作用,使細胞最終凋亡。可見,FAK活性的調控直接影響細胞凋亡,是細胞凋亡研究中又一值得重視的環節。
FAK與細胞因子的串話(crosstalk)
人們早已注意到ECM結合細胞後所引起的促進細胞鋪展、移動、增殖和分化等細胞生物學變化,與其他若干細胞因子或生長激素所誘導的細胞生物學功能變化有許多相同之處。那么,一個信號的轉導與另一個信號轉導,在胞內是否存在交叉以加強生理效應,一直受到科學家的關注。就細胞因子的信號轉導途徑來說,主要有JAK-STAT途徑、PI3K-C-myc途徑和RAS-MAPK途徑等。而ECM-整合蛋白介導的,FAK參與的信號轉導途徑主要是RAS-MAPK途徑,因此二者信號轉導有交叉的可能,也即人們所說的串話。新近在JAK-STAT和PI3K-C-myc途徑中也發現串話,這使原本複雜的信號轉導網路更顯得縱橫交叉串話頻頻。
FAK和JAK，已知生長激素(GH)作用於受體後,使受體二聚化,同時受體與相鄰的JAK激酶相互活化,活化的JAK可以使STAT磷酸化,磷酸化的STAT進一步形成同源或異源二聚體,然後轉位至核內,作用於特定的DNA序列影響基因轉錄。根據GH有促進細胞骨架分子--肌動蛋白重排(reorganization)、細胞趨化、移動等作用,有人就提出GH和ECM-整合蛋白信號轉導可能存在串話。確實在CHO中發現了二者的串話。GH可使FAK發生酪氨酸磷酸化,磷酸化FAK使樁蛋白和張力蛋白磷酸化。深入研究發現FAK活化僅依賴GH受體一個亞基的脯氨酸富集盒1,FAK與JAK2結合,但FAK的位置是在JAK2的下游。有趣的是,GH介導STAT5轉錄活性作用並不需要FAK參與,看來FAK並不是GH受體和ECM-整合蛋白通路的交匯點,但可肯定的是FAK是JAK通路中的新成員。因此不難想像,GH的廣泛生理作用與GH信號藉各種不同的信號分子和通路以擴大效應和功能不無關係。除GH外,HGF、PDGF等均可誘導FAK的酪氨酸磷酸化,可見這種串話的普遍性。與GH不同,胰島素或類胰島素生長因子-1卻使粘附的細胞中FAK去磷酸化,這是迄今為止發現的唯一能拮抗ECM-整合蛋白介導信號轉導的一類細胞因子,也即負性串話。值得指出的是,若細胞處於非粘附狀態即懸浮狀態時,胰島素起到相反作用--促進FAK磷酸化。
除FAK外,RAFTK也是串話的作用點之一。在Kaposi肉瘤細胞中,血管內皮生長因子(VEGF)、bFGF、IL-6和TNF等細胞因子都可使RAFTK發生酪氨酸磷酸化而激活,繼而增加磷酸化RAFTK與樁蛋白結合,使信號轉至下游。RAFTK的串話為細胞因子所結合的受體酪氨酸蛋白激酶與細胞粘附分子轉導信號所涉及的胞質酪氨酸蛋白激酶存在相互作用,提供有力佐證。
FAK和PI3K,細胞內信號轉導網路錯綜複雜,PI3K是其中的重要信號分子之一。它所參與的過程複雜而繁多,近年來發現PI3K涉及GH和胰島素的信號轉導,證實PI3K是胰島素受體的底物(IRS)。PI3K與ECM-整合蛋白介導信號轉導的關係也逐漸了解。體內實驗發現細胞粘附時PI3K的p85亞基酪氨酸發生磷酸化,在體外FAK可使此亞基磷酸化,可見PI3K是FAK的又一底物。PDGF作用細胞時產生FAK磷酸化的同時,也使PI3K發生酪氨酸磷酸化,深入研究FAK-PI3K作用後的下游過程是徹底闡明有關串話全過程的關鍵所在。有如此之多的細胞因子與整合蛋白的信號轉導發生串話,充分說明外界多因素調控細胞生物學特性時,可通過協同或拮抗來達到最終的效應,也是細胞對外界作出的綜合反應。
