染液組分
鹼性染料
這在簡單染色中已討論過，此處用結晶紫。
媒染劑
其作用是增強染料與細菌的親和力，更好地加強染料與細胞的結合。常用的媒染劑是碘液。
脫色劑
幫助染料從被染色的細胞中脫色。利用細菌對染料脫色的難易程度不同，而將細菌加以區分。革蘭陽性細菌不易被脫色劑脫色，而革蘭陰性細菌則易被脫色。常用的脫色劑是丙酮或乙醇，這裡所用的是95%的乙醇。
復染液
也是一種鹼性染料，目的是使脫色的細菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進行比較。這裡用的是蕃紅花紅溶液。
實驗步驟
1。 塗片：左手持菌液試管，右手持接種環，用接種環從試管培養液中取一環菌，從酒精燈外焰穿過，於載玻片中央塗成薄層（事先在背面做好標記圓圈）即可，或先滴一小滴無菌水於載玻片中央，用接種環從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，塗成一薄層。
拔或塞試管塞時，應將試管口通過火焰略加燒灼，最後將接種環在火焰上燒灼滅菌。
2。 乾燥：塗片後在室溫下自然乾燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速乾燥，但勿靠近火焰。
3。 固定：常用高溫進行固定。即手持載玻片一端，標本面朝上，在燈的火焰外側快速來回移動3~4次，共約3~4秒。要求玻片溫度不超過60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷後染色。
4. 染色：
（1）初染： 加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。
（2）媒染： 滴加碘液衝去殘水，並復蓋約一分鐘，水洗。
（3）脫色： 將載玻片上的水甩淨，並襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20—30秒，立即用水沖淨酒精。
（4）復染： 用番紅液染1—2分鐘，水洗。
5. 鏡檢： 乾燥後，置油鏡觀察。 革蘭氏陰性菌呈紅色， 革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的 革蘭氏染色反應為準，過於密集的細菌，常常呈假陽性。
6. 同法在一載玻片上以大腸桿菌與 枯草芽孢桿菌混合製片，作革蘭氏染色對比。
革蘭氏染色的關鍵在於嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應
固定目的
① 殺死微生物，固定其細胞結構；
② 保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免水洗時被水衝掉；
③ 改變菌體對染料的通透性，一般死細胞原生質容易著色。
實驗現象
如果將細菌做革蘭染色，凡是染後菌體呈藍紫色的，稱為“革蘭陽性菌”；菌體是伊紅色，稱“革蘭陰性菌”。無論陽性菌還是陰性菌，都有桿菌和球菌。葡萄球菌、大腸桿菌、 銅綠假單胞菌是臨床最為常見的病原菌，葡萄球菌屬於革蘭陽性菌，大腸桿菌屬於革蘭陰性菌中的腸桿菌科，除大腸桿菌以外，臨床較常見的腸桿菌科細菌還有 變形桿菌屬，沙門菌屬、克霉白菌屬；銅綠假單胞菌是臨床常見的較耐藥革蘭陰性桿菌。
實驗原理
細菌的不同顯色反應是由於細胞壁對乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結構決定的。經結晶紫染色的細胞用碘液處理後形成不溶性複合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步結果是一樣的，但在G+細胞中，乙醇還能使厚的肽聚糖層脫水，導致孔隙變小，由於結晶紫和碘的複合物分子太大，不能通過細胞壁，保持著紫色。在Gˉ細胞中，乙醇處理不但破壞了胞壁外膜，還可能損傷肽聚糖層和細胞質膜，於是被乙醇溶解的結晶紫和碘的複合物從細胞中滲漏出來，當再用襯托的染色液復染時，顯現紅色。紅色染料雖然也能進入已染成紫色的G+細胞，但被紫色蓋沒，紅色顯示不出來。
①革蘭氏陽性細菌的細胞壁
G+細菌細胞壁具有較厚（20-80nm）而緻密的肽聚糖層，多達20層，占細胞壁成分的60%～90%，它同細胞膜的外層緊密相連（圖2-9）。有的G+細菌細胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或胺基酸的酯而存在。由於磷壁酸帶 負電荷，它在細胞表面能調節陽離子濃度。磷壁酸與細胞生長有關，細胞生長中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對自溶素有調節功能，阻止胞壁過度降解和壁溶。
如果細胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細胞成為原生質體（protoplasts），細胞壁不復存在，而只存留細胞膜。除鏈球菌外，大多數G+細菌細胞壁中含極少蛋白質。
②革蘭氏陰性細菌的細胞壁 Gˉ細菌細胞壁比G+細菌細胞壁薄（15～20nm）而結構較複雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）。在細胞壁和細胞質膜之間有一個明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。
外膜 Gˉ細菌細胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細胞質膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重複分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由於糖的種類不同，使各種Gˉ細胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調控外界分子進入細胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G-細菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內毒素（endotoxins）。
肽聚糖層 Gˉ細菌細胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細菌中僅有單
層。肽聚糖層和外膜的內層之間通過脂蛋白連線起來。
壁膜間隙 Gˉ細菌細胞壁的外膜與細胞質膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處於其間，肽聚糖層和細胞質膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠腖態。其間含有三類蛋白質：水解酶，催化食物的初步降解；結合蛋白，啟動物質轉運過程；化學受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。
革蘭染色的醫學意義 ：
1、可以協助鑑定細菌
2、為臨床使用抗生素提供依據
3、有助於了解分析 細菌的致病性
影響因素
操作因素
1、塗片太厚 在塗片時細菌挑的太多，沒法分開，在脫色時就不能將第一步染上的結晶紫的顏色脫去，可能會使革蘭陰性菌也出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。 2、脫色時間 陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時間條件下的結果，如果延長脫色時間，也會使脫色劑滲透進陽性菌的細胞壁中，使染上的結晶紫脫去顏色，最後染上復紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時間太短的話又會使陰性菌染上的結晶紫不能完全脫色，出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。 3、固定方法 固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態結構。固定方法是將乾燥後的細菌塗片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實際操作中有的同學將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會使細菌的染色性發生變化。影響了染色的結果。
細菌因素
1、細菌培養時間 細菌的典型形態、染色性是在對數生長期，取這時的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實的染色性。如果細菌培養時間太長，變成了老齡菌，染色性就會發生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。 2、培養基的成分 一般認為革蘭陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的複合物，它與碘和結晶紫的複合物結合很牢，不易脫色。但是如果培養基中缺乏核蛋白質鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質鎂鹽，細菌與碘和結晶紫的複合物結合就不牢固，容易脫色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
染液因素
1、碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時間太長，或經日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結晶紫與細菌結合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。 2、結晶紫 結晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。 3、酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結晶紫容易被脫去，最後呈紅色。但當酒精的濃度為70% 時，它的脫色能力最強，可能使革蘭陽性菌染上的結晶紫也被脫去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
