非標記抗體免疫電鏡技術

（3）以17 （6）在透射電鏡下4×10倍觀察。 （7）於透射電鏡4×10倍下觀察。

（一） 原理
標記抗體法雖然具有許多優點，但也存在一些難以克服的問題，如標記抗體的分子增大，對細胞膜和組織的穿透力減弱；化學交聯反應對抗體和酶的活性有所影響；結合物中未標記的抗體可與抗原競爭結合，影響檢測方法的敏感性等。不標記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統的非標記抗體的免疫學反應，對組織中的抗原進行定位檢測。不標記抗體法又可分為用標記物顯示和不同標記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法製備雙特異性抗體的F(ab)2，一個Fab片段與標本中的抗原結合，一個Fab是抗體蛋白的結合片段。在抗體與標本作用後，再加入鐵蛋白與抗體結合，從而顯示組織內抗原的所在部位。後者則用磷酸鎢負染後，直接電鏡觀察。
（二）材料及試劑
1．待檢病毒材料 如糞便，氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養液等。
2．高速離心機
3．已知抗體
4．磷鎢酸
5．瓊脂糖
6．其它
（三）操作方法
1．經典法
（1）將被檢病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。
（2）置37℃作用1h或37℃1h後再置4℃過夜。
（3）以17 000r/min～23 000r/min離心90min。
（4）吸去上清，將離心管口倒置於濾紙上，吸去殘留液體。
（5）沉澱物中加少量H2O混懸，用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20Sec～30Sec，滴加於400目銅網Fomnvar膜上，用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多餘的負染液。
（6）在透射電鏡下4×10倍觀察。
2．快速法(瓊脂擴散法)
（1）同經典法(1)、(2)步驟，製備免疫複合物。
（2）以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩衝液製備1%瓊脂糖，趁熱澆注於潔淨的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固後，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數粒，再於凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml，冷卻凝固後，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。
（3）將普通濾紙剪成2×3cm大小，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上。
（4）在凹孔內，加入製備好的含病毒的免疫複合物懸液。
（5）將電鏡載網的Fomnvar膜面向下倒懸於液滴上。由於瓊脂糖的吸水作用，20min～30min後，可將液滴的水分吸乾，而濃縮的免疫複合物則粘附在載網膜上。
（6）在載網膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec，過量的負染液用濾紙在載網邊緣輕輕吸去。
（7）於透射電鏡4×10倍下觀察。
（四）結果判定
直接觀察病毒粒子的形態。由於離心濃縮的處理和特異性抗體的加入，大大提高了觀察的敏感性。