簡介
迭鞘石斛（Dendrobium denneanum Kerr.）為蘭科石斛屬植物，是中藥石斛的來源之一，主要分布於我國四川、雲南、廣西等地，資源豐富，且易於人工栽培，目前在四川的樂山、雅安、洪雅等地已廣泛栽培，並已作為商品藥材廣泛流通於市場。研究表現，迭鞘石斛中多糖類成分是其具有免疫增強和抗腫瘤作用的活性成分。
迭鞘石斛中總多糖的含量測定
為完善藥材質量評價方法及提高藥材的質量標準，本文採用苯酚-硫酸比色法，對迭鞘石斛中的石斛總多糖進行定量分析測定，為迭鞘石斛藥材的質量評價提供依據。材料、儀器與試藥
1.1 材料迭鞘石斛藥材於2007年5月自購於四川省夾江縣華頭鎮，經成都中醫藥大學中藥鑑定教研室陳新副教授鑑定其為蘭科植物迭鞘石斛Dendrobium denneanum Kerr.的乾燥莖。1.2 儀器與試藥UV-1100紫外-可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；BP121S電子分析天平（萬分之一）（德國Sartorius公司）；BP211D電子分析天平（十萬分之一）（德國Sartorius公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；R-21型鏇轉蒸發儀（上海申勝生物科技有限公司）；苯酚、濃硫酸、乙醇等均為分析純（成都科龍化工試劑廠）。
方法與結果
2.1 溶液的製備2.1.1 對照品溶液的製備精密稱取 105℃乾燥至恆重的葡萄糖對照品10.30mg，置 100mL容量瓶中加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含葡萄糖0.1030mg）。
2.1.2 供試品溶液的製備取迭鞘石斛粗粉2.5g，精密稱定，置於圓底瓶中，加80%乙醇100mL回流提取1小時，趁熱過濾，藥渣揮乾，加蒸餾水85mL，回流1小時，趁熱過濾，用5ml熱水洗滌燒瓶和藥渣3次，待冷卻後移入250mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，即得。
2.1.3 苯酚顯色液的製備將50mL濃硫酸緩緩加入10mL水中冷卻至室溫，加入0.6g苯酚晶體攪拌使其溶解，即得。
2.2 迭鞘石斛多糖的精製取迭鞘石斛粗粉50g，加入石油醚（60～90℃）250mL，回流提取1小時脫脂，過濾，揮乾溶劑，以80%乙醇回流提取1小時，趁熱過濾，揮乾溶劑，加入蒸餾水500mL回流提取2次，每次1小時，減壓濃縮至150mL，用0.1%的活性炭脫色，過濾，加入95%乙醇使溶液含醇80%，靜置過夜，沉澱物依次用無水乙醇、丙酮洗滌，60℃減壓乾燥，製得灰白色粉末狀迭鞘石斛多糖。
2.3 最大吸收波長的選擇分別精密稱吸取供試品溶液0.5mL、對照品溶液1.0mL分別置具塞試管中，加水至2mL，再加顯色液5.0mL，搖勻，放置5分鐘，置沸水浴中加熱30分鐘後，取出，迅速冷卻到室溫。另取2.0mL水作同上平行操作，作為空白對照，在400～600nm之間掃描。結果表明，對照品溶液和供試品溶液在490nm處有最大吸收峰，故選擇490nm作為測定波長。
2.4 標準曲線的製備精密移取對照品溶液0.1mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0mL分別置具塞試管中，按照“2.3.”項下方法，自“加水至2mL”起操作，另取2.0mL蒸餾水同法操作，作為空白對照，在490nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。經計算得回歸方程為A=0.0506C+0.0631，相關係數r=0.9995。結果表明，葡萄糖濃度在1.47～14.7μg·mL範圍內，線性關係良好。
2.5 顯色穩定性試驗取葡萄糖標準溶液1.0mL，按“2.3”項下操作顯色，在不同時間點測定其吸光度。結果表明，顯色在4小時內穩定性良好，結果見表1。表1 穩定性試驗結果Tab.1 Stability Test resultsT（h）00.51.02.03.04.0RSD(%)A0.5130.5070.5120.5100.5150.5160.65
2.6 換算因素的測定精密稱取60℃乾燥至恆重的迭鞘石斛多糖50.87mg置於100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即可。精密吸取0.5mL，按照“2.3.”項下方法，自“加水至2mL”起操作，另取2.0mL水為空白，在490nm處測定吸光度。另精密吸取葡萄糖對照品溶液0.8mL，同法操作，測定吸光度。按照下面公式計算換算因素f=（W*1000）/C*D（其中W：稱取多糖的重量（mg）；C：溶液中單糖的濃度（μg·mL）；D：稀釋因素，即稀釋後的總體積）。
2.7 精密度試驗精密吸取對照品溶液1.0mL，照“2.3.”項下方法，自“加水至2mL”起操作，在490nm處測定吸光度，連續測定6次，其RSD=0.73%，表明儀器精密度良好，結果見表2。表2 精密度試驗結果Tab.2 Precision Test resultsN123456RSD(%)A0.5060.5120.5070.5100.5080.5160.73
2.8 加樣回收率試驗取已知含量的迭鞘石斛藥材6份，每份約0.1g，精密稱定，分別精密加入石斛多糖17mg，按樣品測定方法測定，計算，結果見表3。表3 加樣回收試驗結果Tab.3 Average recovery of Polysaccharide SamplesContent/mgAdded/mgFound/mgRecovery /%Average recovery/%RSD/%117.5117.4334.4598.6 98.6 1.15216.1516.5432.5199.5317.3417.3833.7497.2418.0217.8235.95100.3516.4916.3632.2798.2618.3618.1135.6897.8
2.9 樣品的測定 取各批迭鞘石斛藥材樣品（見表4）粉末各2.5g，精密稱定，按照“2.1”項下供試品溶液製備方法製備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液0.5mL，按照“2.3”項下方法，自“加水至2mL”起操作，另取2.0mL水為空白，在490nm處測定吸光度。另精密吸取葡萄糖對照品溶液0.5mL，同法操作，測定吸光度。按照下面公式計算各樣品中石斛多糖的含量：多糖含量（%）=（C*D*f*10-6）/W *100%（其中C：樣品提取液中按標準曲線計算出的單糖濃度（μg·mL）；D：稀釋因素，即稀釋後的總體積；f：換算因素；W：樣品重量（g）。）表4 不同批次藥材中石斛多糖含量測定結果（n=3）Tab.4 Results of determination of samples（n=3）SamplesContent/%117.21216.51316.12417.51
4批藥材中石斛多糖含量在16.12～17.51%之間。
討論
3.1 本文採用改進後的硫酸-苯酚法對多糖含量進行測定，傳統的硫酸-苯酚法的操作是：加5%苯酚溶液後，再加入濃硫酸，振盪顯色，加入濃硫酸時，系統顯色溫度相差較大，而造成相應的偶然偏差。而改進後的方法，由於先把水和硫酸混合，對濃硫酸起到了稀釋作用，待冷卻最後加入苯酚晶體，配成顯色液，通過沸水浴加熱來使其顯色，保證了反應系統溫度一致，很好地解決了檢測的重現性與準確度。3.2 實驗過程中，僅收集到4批迭鞘石斛藥材，還需進一步擴大樣本量，才能全面反映各地藥材的質量信息。本研究為迭鞘石斛藥材的質量評價提供依據，為其進一步開發利用打下了基礎。
