微生物吸收利用硝酸鹽有兩種完全不同的用途，一是利用其中的氮作為氮源，稱為同化性硝酸還原作用：NO →NH →有機態氮。許多細菌、放線菌和黴菌能利用硝酸鹽做為氮素營養。
另一用途是利用NO 和NO 為呼吸作用的最終電子受體，把硝酸還原成氮（N），稱為反硝化作用或脫氮作用：NO →NO →N↑。能進行反硝化作用的只有少數細菌，這個生理群稱為反硝化菌。大部分反硝化細菌是異養菌，例如脫氮小球菌、反硝化假單胞菌等，它們以有機物為氮源和能源，進行無氧呼吸。
反應機理
總的反硝化過程可以用以下方程式表示：
• 2 NO + 10 e + 12 H → N+ 6 HO, ΔG = −333 kJ/mol
其中包括以下四個還原反應還原反應：
硝酸鹽（NO ）還原為亞硝酸鹽（NO ）：2 NO + 4 H + 4 e → 2 NO + 2 HO
亞硝酸鹽（NO）還原為一氧化氮（NO）：2 NO+ 4 H + 2 e → 2 NO + 2 HO
一氧化氮（NO）還原為一氧化二氮（NO）：2 NO + 2 H + 2 e → NO + HO
一氧化二氮（NO）還原為氮氣（N）：NO + 2 H + 2 e → N + HO
1.亞硝酸鹽（NO）還原為一氧化氮（NO）：2 NO+ 4 H + 2 e → 2 NO + 2 HO
2.一氧化氮（NO）還原為一氧化二氮（NO）：2 NO + 2 H + 2 e → NO + HO
3.一氧化二氮（NO）還原為氮氣（N）：NO + 2 H + 2 e → N + HO
以上四個反應均為放熱反應，所以在無氧或缺氧條件下，細菌可以將硝酸鹽（NO ）作為電子傳遞鏈(ETC)的最終電子受體（TEA, terminal electron acceptor），來完成物質能量交換。
參與的微生物
反硝化菌在自然界以各種形式廣泛存在，如：
• Paracoccus denitrificans（自養，氧化氫氣H）
• Thiobacillus denitrificans（自養，氧化硫化物（S）或者硫代硫酸鹽（SO））
• Pseudomonas stutzeri（異養，氧化有機碳）
反硝化菌主要為原核生物，大量存在於在α-, β- 和γ-變形菌綱中。已知的反硝化菌的屬有 Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium等。
大部分反硝化細菌是異養菌，例如脫氮小球菌、反硝化假單胞菌等，它們以有機物為氮源和能源，進行無氧呼吸。少數反硝化細菌為自養菌，如脫氮硫桿菌，它們氧化硫或硝酸鹽獲得能量，同化二氧化碳，以硝酸鹽為呼吸作用的最終電子受體。
影響反應的因素
碳源
在污水生化處理過程中，能為反硝化細菌利用的碳源主要有污水中的碳源以及外加碳源。如果能夠利用污水中的有機碳作為碳源是比較經濟的。這要求污水中的BOD/TN值大於3-5，如果不滿足要求則需外加碳源。常用的外加碳源為甲醇，因為甲醇被分解後主要生成二氧化碳和水，不殘留任何難降解的物質，而且反硝化速率高。
pH值
pH值是反硝化過程的重要影響因素，反硝化細菌最適的pH值範圍為6.5-7.5，此時的反硝化速率最高；當pH值不在此範圍內時，反硝化速率明顯下降。
溶解氧
反硝化細菌是異氧兼性菌，只有在無分子氧的條件下反硝化菌才能利用硝酸鹽或亞硝酸鹽中的氧進行呼吸，使氮原子得到還原。如果反應器中的溶解氧濃度過高，分子態氧成為供氧物質，將使硝酸氮的還原過程受到抑制。
溫度
反硝化細菌的最適生長溫度為20-40℃，低於15℃時，反硝化速率明顯降低。因此，在冬季低溫季節，為了保持一定的反硝化速率，需要提高污泥停留時間，同時降低負荷，提高污水的停留時間。
反硝化的意義
氮循環 反硝化反應在自然界具有重要意義，是氮循環的關鍵一環，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO 減少，消除因硝酸積累對生物的毒害作用。它和厭氧銨氧化（Anammox）一起，組成自然界被固定的氮元素重新回到大氣中的途徑。
農業生產方面，反硝化作用使硝酸鹽還原成氮氣，從而降低了土壤中氮素營養的含量，對農業生產不利。農業上常進行中耕鬆土，以防止反硝化作用。
在環境保護方面，反硝化反應和硝化反應一起可以構成不同工藝流程，是生物除氮的主要方法，在全球範圍內的污水處理廠中被廣泛套用。
利用與控制
利用硝化作用和反硝化作用去除有機廢水和高含量硝酸鹽廢水中的氮，來減少排入河流的氮污染和富營養化問題，已是環境學家的共識。利用各種反應器處理城市的或其他廢水時，有機廢水中的碳源可支持反硝化作用，進行有效的生物脫氮。污水處理中所利用的反硝化菌為異養菌，其生長速度很快，但是需要外部的有機碳源，在實際運行中，有時會添加少量甲醇等有機物以保證反硝化過程順利進行。
反硝化作用能造成氮肥的巨大損失，從全球估計，反硝化作用所損失的氮大約相當於生物和工業所固定的氮量。施用硝化抑制劑可收到良好的效果。
