使用背景
隨著近年來農藥品種、產量及使用量劇增，農業生產過程中混用及施用多種農藥的現象較為普遍，國內外在食品安全風險監測結果中發現同一農產品含有多種農藥殘留的現象比較突出。2007年，歐盟食品農藥殘留風險監測結果顯示，有近26%的食品中含有多種農藥殘留，其中含3種以上的占總樣品數的6.3%，單個產品中最多含有8種農藥。從筆者等2013年對浙江省草莓的檢測情況看，同一樣品甚至含有10種農藥殘留，含3種以上農藥殘留的比率超過總樣品數的20%(未報導)。目前我國在制定農藥殘留限量時一般僅考慮單一農藥的風險，在各類監測項目中對不合格產品的判定也是以某一種農藥是否超標作為標準，尚未考慮多種農藥同時殘留的情況。研究表明，與暴露於一種農藥殘留相比，人體同時或者先後暴露於多種農藥殘留可能引起更高或者更低的聯合效應。因此，傳統的僅針對單一農藥品種進行評估的方式可能會造成對風險程度的低估或者高估。美國在1996年的《食品質量保護法》中已要求其環保局(EPA)在制定農藥殘留限量時須考慮來源於不同暴露途徑的多種農藥的聯合效應。歐盟396/2005號法規也規定了在制定農藥殘留限量時必須考慮農藥的累積性風險(歐盟和美國評估機構稱聯合暴露風險評估為“累積性風險評估”)。近年來，農藥聯合暴露受到了越來越多的關注。美國環保局連續出版了多部混合物風險評估報告與指南，完成了5組機理相同的農藥的聯合暴露的風險評估。2007年，世界衛生組織國際化學品安全規劃署(WHO/IPCS)為混合化合物的風險評估制定了通用框架，並推薦了分階段推進評估法(tiered risk assessment)。歐盟食品安全局(EFSA)專門成立了累積性風險評估工作組，其植物保護產品和殘留科學委員會(PPR)提出了多種農藥聯合暴露的累積性風險評估方法，並制定了機理相同或相似農藥的累積性評估組(cumulative assessment group，CAG)分組標準，為農藥的聯合暴露風險評估提供了大量的基礎數據。2012年，該組織又進一步推薦了不同作用方式農藥的聯合暴露風險評估方法。此外，荷蘭健康委員會(Heath Council of The Netherlands)、挪威食品安全委員會(Norwegian Scientific Committee for Food Safety，VKM)也相繼開展了農藥殘留聯合暴露風險評估研究，並各自出版了相應的指南報告。
雖然我國農藥殘留風險評估工作起步較晚，但有關農藥聯合暴露風險評估的探索已取得一定進展。陳晨等採用相對毒效因子法(relative potency factor，RPF)對中國大米中的有機磷類農藥殘留風險進行了評估，並對多種農藥在多種環境生物中的聯合毒性進行了探索;袁玉偉等採用機率性評估方法研究了浙江地區蔬菜中毒死蜱和氯氰菊酯聯合暴露的膳食風險;李耘等對混合化合物風險評估中不同情境下的建模技術進行了綜述。本文針對我國農產品中的農藥多殘留現狀，綜合目前國外常用的聯合暴露評估方法，以楊梅中農藥殘留暴露評估為例，重點介紹了具有相同作用機理農藥的聯合暴露評估分組方法和常用評估方法，闡述並分析了各方法的套用範圍、數據要求及優缺點，以期為促進我國農產品中農藥多殘留的聯合暴露風險評估研究提供參考。
聯合暴露定義
不同國家對多種化合物聯合暴露的定義不同。美國環保局採用“累積性暴露(cumulative risk assessment)”概念，即“多種物質多個途徑的暴露(combined exposure to multiple chemicals including all routes)”，其暴露途徑包括飲用水、食品以及環境。歐盟在396/2005號法規中也採用了“累積性暴露”的說法，但是其範圍與美國環保局定義的範圍不同，歐盟的“累積性暴露”指“食品中多種化合物的聯合暴露(combined exposure in food)”，即僅僅只考慮通過膳食攝入的暴露，不涉及其他途徑的暴露。世界衛生組織國際化學品安全規劃署建議採用“多種化合物的聯合暴露(combined exposure to multiple chemicals)”替代“累積性暴露”。該組織認為，聯合暴露風險評估應包含兩種暴露情景，即“多種化合物多種途徑的聯合暴露(combined exposure to multiple chemicals by multiple routes)”和“多種化合物單一途徑的暴露(combined exposure to multiple chemicals by a single route)”，在討論食品中化合物暴露風險時，應採用“多種化合物的聯合暴露”這一概念。
相比較可見，上述關於聯合暴露的定義中，世界衛生組織國際化學品安全規劃署的定義最為簡潔和清晰，可以避免因不同機構定義的範圍不同而造成的混淆。因此，本文擬採用該組織推薦的“聯合暴露”概念來描述多種農藥在農產品/食品中殘留的聯合暴露風險。
研究現狀
聯合作用的類型農藥殘留聯合暴露風險評估毒性效應評價的關鍵取決於聯合作用的類型。自1939年Bliss首次提出化合物聯合作用(combined effect)的概念後，Finney、Hewlett等及Ashford等先後對混合物的聯合作用進行了探索。目前普遍認為食品中農藥殘留的聯合作用形式主要有3種：濃度相加(concentration addition，CA)、獨立作用(independent action，IA)和相互作用(interaction)。
濃度相加也被稱為劑量相加(dose addition，DA)，是指當幾種農藥在化合物結構上為同系物或其毒性作用靶器官相同、毒性作用機制相似時，機體暴露於多種農藥中所產生的總效應等於各種農藥單獨效應之和，即農藥毒性呈相加作用。獨立作用也被稱為效應相加(response addition，RA)，是指不同農藥由於毒性作用的受體、部位、靶器官等不同，因此所引起的生物學效應互不干擾，同時或者先後暴露於兩種或者兩種以上這樣的農藥時對機體的影響表現為每種農藥各自的毒性。相互作用則是指兩種或者兩種以上化合物的聯合毒性效應不同於劑量相加和效應相加，而是產生了協同作用或者拮抗作用的情況，其作用程度與化合物的劑量水平、暴露途徑、暴露時間和持續時間以及生物靶標有關。
聯合毒性效應研究進展目前，關於與人類和哺乳動物毒理學相關的混合物聯合毒性效應的研究報導較少，相關研究主要集中在生態毒理學方面，並主要側重於二元混合污染，以農藥對細菌、藻類及大型溞等生物的毒性測定為主，也有利用魚類或陸生無脊椎動物蚯蚓、線蟲等進行農藥毒性研究的報導。多項研究認為，作用機制相似的農藥的聯合毒性可通過濃度相加方法進行準確預測，只有極少數毒性作用不同的混合農藥更適合採用獨立作用的方式進行評估。Altenburger等研究了海藻中二元混合物的慢性毒性，通過137種農藥的兩兩混合試驗，證明了其毒性效應具有濃度相加的特徵;Faust等採用38種殺蟲劑和殺菌劑，兩兩混合進行試驗，發現66%的混合物的聯合毒性符合濃度相加方法預測結果。Deneer在綜述中重新評估了202個農藥混合物的試驗結果，認為在高於90%的情況下，通過濃度相加方法均可準確評估混合物的聯合毒性，偏差不超過2倍，尤其是對於85%的重新評估的化合物，雖然其作用機理不同，但通過濃度相加方法仍可準確評估其聯合毒性。Belden等在2007年發表的大樣本研究結果為這些早期的發現提供了依據，他們將207個採用濃度相加方法評估得到的農藥混合物聯合毒性結果和37個採用獨立作用方法得到的評估結果，通過模型偏差率(MDR)表征了預測與實測的混合物毒性比率。結果發現：濃度相加方法的MDR中值為1，5%試驗的MDR值大於2，另外有5%試驗的MDR值小於0.5，表明該方法的平均預測能力較高 。Belden等指出，濃度相加是一種略為保守的方法，可廣泛套用，但可能由於存在相互作用而低估真實的效應。
獨立作用法計算聯合毒性的理論基礎是統計學上獨立事件發生的機率。該方法利用混合物中各組分的單一效應來評價聯合毒性，認為單一物質在低於其效應水平時，將不會對聯合效應產生貢獻，若所有的組分都低於效應水平，則聯合效應為零。基於此假設，歐盟食品安全局植物保護產品和殘留科學委員會認為食品中的農藥殘留水平一般不會超過其毒性閾值，基本不會發生聯合作用。因此，該委員會在針對食品中的農藥多殘留進行聯合暴露評估時一般不考慮獨立作用的情況 。
相互作用一般有3種形式：化合物之間的直接反應、毒物動力學反應和毒效動力學反應。目前對於相互作用的認識都是來源於較高濃度的暴露，這些暴露量遠遠超過了食品中的實際暴露量。然而，高暴露量下所產生的反應並不意味著能與低暴露量時的反應相關。多個研究機構曾討論過食品中的暴露情況，英國毒理委員會、歐盟食品安全局植物保護產品和殘留科學委員會以及歐盟非食品委員會認為:儘管不能排除食品中的多種農藥殘留會發生相互毒性作用，但至今尚無充分的實驗證據證明農藥在食品中的殘留水平能夠發生相互作用。 在生態毒理學領域，就套用濃度相加法和獨立作用法分別得到的聯合毒性效應預測結果進行系統對比分析後證明:濃度相加法評估的結果更為保守，但總體來講，兩種評估方法所得結論在數值上差異並不大。目前一般將濃度相加法作為混合物毒性風險評估的默認方法。其原因主要是基於兩點:第一，濃度相加法評估中對數據的要求沒有獨立作用法嚴格，濃度相加法適合評估有效的暴露量，而獨立作用法則需要繪製全面的暴露量-反應曲線，尤其當暴露量很低時。第二，前瞻性的混合物毒性效應評估應遵從預防為主的原則，而濃度相加法能得出更為保守的估計值，因此在生態毒理學領域得到了廣泛的套用。但濃度相加法在人類毒理學中套用的研究還較為滯後，仍基於“濃度相加法是大範圍適用的”這一尚存爭議的假說基礎上，這與世界衛生組織國際化學品安全規劃署的觀點相符。在設計多組分化合物的聯合暴露風險評估框架時，國際化學品安全規劃署認為，若無法辨別協同或拮抗作用，則在最低級別的評估中應採用濃度相加法。在目前的聯合毒性效應評估中，濃度相加法套用最為成熟和廣泛，該方法已被不同的評估機構如歐盟食品安全局植物保護產品和殘留科學委員會及美國環保局指定為最基本的預設方法。
方法
評估分組
理論上講，當化合物的作用機理相同時，即使單個化合物的暴露量低於其無作用劑量，在聯合暴露的情況下也可能產生明顯的不良效應。美國環保局在1999年就提出:對具有相同分子靶標的化合物，例如作用於乙醯膽鹼酯酶的有機磷類農藥，可作為一個評估組進行評估，這種評估組被稱為共同機制組(common mechanism group，CMG)。以此作為分組依據，美國環保局評估了5組具有共同作用機制的農藥：有機磷類、氨基甲酸酯類、三嗪類、氯代乙醯苯胺類和除蟲菊酯/擬除蟲菊酯類。在此基礎上，歐盟食品安全局提出了累積性評估組(CAG)的概念。累積性評估組較共同機制組包含的內容更為廣泛，其不僅包含作用機理相似的農藥，也包含機理不同但毒性作用相似的農藥。歐盟食品安全局認為，除了把具有相同分子靶標的農藥歸為同一評估組外，作用於相同靶器官的農藥也可以歸類為同一個評估組。無論是共同機制組還是累積性評估組，都是以濃度相加法為基礎對風險進行疊加計算。為進一步推進農藥評估組的建立，歐盟食品安全局收集了2009年5月1日之前所有已登記農藥的相關毒理學數據，並根據不同農藥對不同靶標器官的作用進行了歸類。隨後，Wolterink等完成了所有已登記農藥對神經系統、肝臟和生殖發育系統的不良效應的分組。這些工作給其他國家的相關研究提供了借鑑及基礎數據來源。在風險評估方法的選擇上一般都以濃度相加法為基礎。最常用的幾種聯合暴露評估方法包括危害指數法(hazard index，HI)、相對毒效因子法(relative potency factor，RPF)、暴露閾值法(margin of exposure，MOE)及分離點指數法(point of departure index，PODI) 。
危害指數法
危害指數法適用於毒性相似且具備明確劑量-反應關係的一組化合物，其單個化合物的關鍵效應可通過劑量-反應關係確定，再通過不確定因子外推得到安全參考劑量。一般是將無作用劑量(no adverse effect level，NOAEL)外推100倍，獲得其安全參考劑量:每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)和急性參考劑量(acute reference dose，ARfD)，其中ADI用於描述慢性毒性，ARfD用於描述急性毒性。單個化合物的暴露量與其安全參考劑量的比值則為該單個化合物的風險，將不同化合物的風險相加即得到聯合暴露風險。其計算方法見公式：HI=∑ni=1EiRfDi，式中Ei為單個化合物的暴露量，RfDi是單個化合物的安全參考劑量。雖然“安全參考劑量”在不同國家的具體表現形式不同，但其實際意義相同。美國環保局採用參考劑量(reference dose，RfD);世界衛生組織國際化學品安全規劃署採用ADI或者ARfD。但是無論哪種形式，在進行聯合暴露風險描述時，都是將不同化合物的暴露量與其安全參考劑量的比值相加，從而得到聯合暴露風險指數HI。當HI小於1，表明聯合暴露風險可以接受;大於1，則表明存在潛在的健康風險。
該方法使用快速簡便，易於理解，適用於以初步篩查為目的的聯合暴露評估。但是由於該方法是基於健康參考劑量進行計算的，因此對於超過健康參考劑量的風險無法進行準確的描述。此外，參考劑量的使用也包含了不確定因子，參考劑量未必能夠代表不同化合物真實的毒理學意義上的量。
分離點指數法
分離點指數法中的分離點一般採用無作用劑量或者基準劑量(bench mark dose，BMD)來表示，將每個化合物的暴露量與其分離點的比值相加即得到聯合毒性效應。其計算方法見公式：PODI=E1POD1+E2POD2+…+EnPODn=∑ni=1EnPODi，式中POD是每個化合物的分離點，PODI是聯合暴露的風險指數，求出PODI後再乘以不確定因子(一般採用100)，若結果小於1，表明其聯合暴露風險為可以接受。採用分離點指數法對楊梅中的農藥殘留數據進行評估，得：PODI=0．0015/1．48+0．00016/0．25+0．00025/0．08=0．0047引入不確定因子100，結果為0.47，小於1，表明該聯合暴露風險同樣為可以接受。歐盟食品安全局推薦採用分離點指數法代替危害指數法。分離點指法比危害指數法更加透明，不需要在計算過程中引入不確定因子，而是直接採用實驗數據，最後再引入不確定因子。在實際套用中，POD的選擇一般採用NOAEL數據。但該方法也存在一定的不足。首先，NOAEL數據是根據動物實驗或人群流行病學調查結果得到的、未觀察到不良健康效應的最大劑量，僅選用了一個點的數據，忽略了整個劑量-反應曲線的斜率。其次，NOAEL值是根據統計學檢驗與對照組無統計學差異而確定的數值，其與樣本大小有關，受實驗設計劑量的影響。因此，毒理學界提倡以基準劑量(BMD)代替NOAEL。BMD是指能使某種效應增加到一個特定反應水平時的劑量，其方法是將按劑量梯度設計的動物試驗結果，通過適當的模型計算，求得5%陽性效應反應劑量的95%置信區間下限值，即為BMD。採用BMD代替NOAEL有較大的優勢，因為BMD參數利用的是毒性測試研究中劑量-反應關係的全部資料，所得結果的可靠性、準確性更好。但基準劑量方法套用的最大局限性是有些化合物不具備相關信息，數據獲取非常困難。整體來看，分離點指數法的不足之處是國際上尚無統一的評價方法。目前較為常用的方法是通過乘以一定的不確定因子把PODI轉化成“風險杯”(risk cup)單位。如可以採用不確定因子100，則當風險杯數值≤1時，表示該聯合暴露風險為可以接受。
相對毒效因子法
該方法適用於評估同一類別的化合物，要求受試農藥具備相同的毒理學終點、相同的暴露途徑和持續時間。每種農藥的毒性效應通過指數化合物來表示，指數化合物一般選擇混合物中較為典型、且研究數據比較充分的化合物。將混合物中各農藥乘以其毒效因子，轉化成指數化合物的等量物，相加後即得到聯合暴露濃度。將聯合暴露濃度與指數化合物的參考值進行比較，若聯合暴露濃度低於指數化合物的參考值，則認為風險可以接受;反之，則認為該殘留水平可能存在風險，需要加強對所評估農藥和產品的監管，降低殘留濃度。相對毒效因子法已被用於40餘種乙醯膽鹼酯酶抑制劑類農藥的聯合暴露風險評估;Caldas等採用該方法對巴西膳食中的25種有機磷和氨基甲酸酯類農藥的聯合暴露風險進行了評估;Müller等採用該方法評估了4種抗雄性激素類農藥的聯合暴露風險。美國環保局制定了4組化合物的相對毒效因子(RPFs)：多氯聯苯、多環芳烴和有機磷農藥，並在其指南中給出了RPF的計算方法：Cm=∑ni=1Ck×RPFk，式中，Cm是以指數化合物表示的混合物濃度;C1為指數化合物的濃度;Ck為化合物k的濃度;RPFk是化合物k相對於指數化合物的毒效因子。
暴露閾值法
2005年，歐盟食品安全局與世界衛生組織聯合舉辦了關於“多種化合物暴露的聯合毒性”國際會議，在會議報告中指出，暴露閾值法最適合用於評估遺傳毒性致癌物。暴露閾值(MOE)的計算方法見公式：MOE=PODExposure，式中，MOE為單個化合物的暴露閾值，是參考劑量(POD)與人體暴露量的比值。POD是劑量-反應曲線上的一個劑量值，一般採用BMD10。目前尚未建立採用MOE衡量聯合暴露風險的標準。通常認為:單個化合物的MOE高於100，風險為可以接受，MOE數據越大，說明風險指數越低。當計算單個化合物的MOE時，如果數據是從動物試驗中獲得，通常認為MOE>100時風險是可以接受的，但如果數據是來源於人體試驗，則MOE>10為可以接受。對於遺傳毒性致癌物，歐盟食品安全局植物保護產品和殘留科學委員會認為，如果單個物質的MOE不低於10000，則不會引起健康風險。聯合閾值(MOET)是指單個化合物暴露閾值倒數之和的倒數。MOET=∑ni=111/MOEi=1PODI，一般認為，當MOET大於100時，其聯合暴露風險為可以接受。
