前言
經過幾個世紀許多人的努力，我們現在對耳蝸的結構和生理活動已經有了比較深入的認識，但仍有許多難解之謎。自上世紀70年代以來，在內耳聽覺生理研究領域的一系列重大發現不僅使我們對聽覺系統有了全新的深入的認識，也促使研究工作出現了飛躍性的進展。對內耳感覺細胞的研究不僅深入到分子甚至亞分子水平，研究的範疇也出現了生理學與形態學、生物物理學、生物化學、分子生物學、免疫學、遺傳學等多學科相互滲透的格局。
歷史回顧
人耳聽覺有著極其精細的分辨力和極為寬廣的動態範圍。譬如，在1000 Hz的頻率，人耳可以聽到引起鼓膜振動僅相當於質子直徑大小的聲音；可分辨在20 Hz至20000 Hz範圍內不同頻率聲音的音調，甚至靈敏到能夠辨別頻率相差不到1 Hz的兩個音調；可感受強度相差120 dB（100萬倍) 的聲音。過去一直認為耳蝸是一個被動的外周聽覺感受器，它的作用僅為被動地將聲音機械振動能量轉換為生物電能，形成神經衝動，而對聲音的精細分辨是由聽覺中樞完成的。但是，耳蝸這么精細的分辨能力、這么大的聽覺感受範圍，是任何一個被動的換能器所無法做到的。近30年來的研究已經證實，耳蝸記憶體在著一個被稱為“耳蝸放大器”（cochlear amplifier）的對聲音進行分析處理的主動機制，使耳蝸能達到十分敏銳的聽覺感受能力。
早在1948年，美國科學家Gold即首次從理論上提出耳蝸內可能存在一個耗能的主動生理機械過程，這一過程有助於使耳蝸調諧變得更加精細。但他的這一觀點當時未引起任何注意。1971年Rhode報告了松鼠猴基底膜振動的非線性特點，即基底膜振動隨刺激聲強增加而增大的比率小於1 dB/dB；而且基底膜反應的非線性具有頻率選擇性，即僅能在最佳頻率附近觀察到。從理論上看Rhode實驗中所使用的聲刺激強度是不會引起一個被動系統產生非線性反應的，因此，他觀察到的耳蝸的非線性反應表明基底膜運動並非一個簡單的被動過程，而是有其他機制的參與，這實際上為Gold的耳蝸主動機制假說提供了非常重要的實驗依據。遺憾的是，Rhode的這一發現在當時也未被重視。
1978年，英國科學家Kemp報導了耳聲發射現象，即耳蝸內有某種機制產生機械能量，通過耳蝸淋巴液的液波振動引起聽骨鏈和鼓膜振動，使外耳道的空氣發生振動而產生聲音，這些微弱的聲音用高度靈敏的微音器可以記錄到。耳聲發射的發現為耳蝸主動機制的存在提供了最直接的證據，儘管這一重大發現的論文在最初投到著名的《自然》（“Nature”）雜誌時被審稿專家和編輯以極其荒唐的理由拒之門外，值得慶幸的是，《美國聲學學會雜誌》接受並發表了這一論文。Kemp的這一發現立即引起聽覺研究者的重視並很快被廣為接受。耳聲發射的發現為聽覺生理學研究提供了全新的概念和研究方向，使人們對耳蝸功能的認識發生了根本性變化，它的發現是現代聽覺生理學具有劃時代意義的重大突破。
在Kemp發現耳聲發射之後，許多科學家從形態和生理方面進行了大量工作，探索耳聲發射的起源和產生機制。Mountain（1980）報導外毛細胞的耳蝸傳出神經受到電刺激而興奮時，或蝸內電位（EP）改變時，都會改變耳蝸產生的畸變音，這說明外毛細胞至少能間接影響基底膜的振動。Weiss（1982）提出了“雙向換能”的概念以描述耳蝸內的聽覺過程，他認為毛細胞的機械運動引起電反應過程（“順向換能”），這些電反應過程再引起毛細胞的機械運動（“逆向換能”）。1983年，Davis提出了著名的“耳蝸放大器”學說，提出耳蝸記憶體在著與放大器功能相類似的主動機制，能放大基底膜行波波峰處的基底膜振動，從而使耳蝸具備靈敏的聽覺和精細的頻率分辨能力，外毛細胞是耳蝸放大器工作必不可少的物質基礎。同時，Neely和Kim（1983）發表了蝸隔振動的“主動模型”，提出外毛細胞能產生動力以克服部分機械阻力。1983年，Brownell及其同事觀察到了哺乳類動物外毛細胞的電誘發運動，他們發現外毛細胞在受到電刺激時會發生與電刺激頻率相同的沿胞體縱軸的快速伸長及縮短運動，將這一現象稱為“電能動性”或“電致運動”（electromotility），並於1985年將他們的發現發表在《科學》雜誌上，從而確認了耳聲發射和電-機械正反饋來源於外毛細胞的主動運動（Brownell et al,1985）。
隨後一系列有關離體外毛細胞電生理的研究深化了對外毛細胞的生理活動及其在耳蝸聽覺放大過程中的作用的認識。Ashmore等對外毛細胞的“電能動性”進行了系統的研究，並揭示了外毛細胞門控電流與電能動性的關係（Ashmore，1987；Housley & Ashmore,1992）。隨後，Santos-Sacchi（1992）發現了胞膜的容抗和阻抗所形成的低通濾波特性對外毛細胞電能動性的限制，使離體外毛細胞的電致運動在1000 Hz以上就大幅度衰減。Evans和Dallos（1993）發現了外毛細胞頂端的纖毛擺動與胞體電能動性之間的關係。針對胞膜的低通濾波特性，Dallos和Evans（1995）通過數學模型和為離體外毛細胞電生理研究而設計的“微腔”（micro-chamber）技術所得到的實驗數據，提出胞外電位不受胞膜低通濾波特性的限制，能為在體外情況下毛細胞的高頻運動提供足夠的動力。Frank等（1999）用“微腔”技術對外毛細胞電致運動的研究發現，外毛細胞電致運動的頻率至少可高達79 kHz。2000年，Dallos實驗室的鄭菁（Zheng et al，2000）等科學家套用分子生物學和細胞電生理方法，成功地確認了外毛細胞的運動蛋白，將其命名為“prestin”（快動蛋白），在《自然》雜誌上發表了他們的研究結果。他們的卓越工作立即引起聽覺研究學界的轟動，引發了對外毛細胞電致運動的新一輪研究熱潮。這一發現的意義在於確定了外毛細胞電致運動的物質基礎，其重要性不亞於外毛細胞電致運動的發現。隨之，Liberman等（2002）用左健實驗室培育出的prestin基因敲除小鼠，證實了prestin對活體耳蝸聽覺的重要作用。
上述外毛細胞電致運動是指在感受器電位控制下外毛細胞胞體的伸長和縮短。在上世紀80年代開始，人們陸續發現龜、蛙、鳥、蜥蜴等非哺乳類動物毛細胞纖毛的主動運動（擺動），有人提出耳蝸聽覺的兩種機制模型（Kim，1986），即纖毛負責快運動，胞體負責慢運動。但在相當長的一段時期，在哺乳類動物的耳蝸並沒有發現纖毛的主動運動。2003年，Fettiplace實驗室報導了大鼠耳蝸由外毛細胞纖毛機械-電換能通道的快適應機制所介導的纖毛主動運動，使纖毛的能動性成為人們關注的課題（Kennedy et al,2003）。
外毛細胞胞體的電致運動
一、外毛細胞外側壁獨特的超微結構
外毛細胞的外側壁是一獨特的三層結構，厚度約100 nm。最外一層是細胞質膜，中間一層是皮層格線（cortical lattice），最內一層是膜下間池（subsurface cisterna）。
1．膜下間池 在結構上類似內質網，腔內直徑約20 nm，但不屬於細胞質膜-內質網-高爾基體膜性池。膜下間池的功能尚不清楚，但它將細胞質分隔為兩部分：軸心部和池外間隙。這樣分隔的意義可能在於維持細胞支架和細胞器工作的分工。
2．皮層格線 介於膜下間池和細胞質膜之間（也就是“池外間隙”，該間隙寬約30 nm），是外毛細胞的主要支架結構，呈格線樣結構，主要由兩種細絲狀纖維交織而成，並由許多排列規則的小柱與其外側的細胞質膜相連。格線的纖維一種為環繞細胞的環行纖維，直徑約5 nm，纖維間距約40 nm，纖維的成分主要為肌動蛋白（actin）；另一種纖維為縱行纖維，與細胞的縱軸成9º～10º並與環行纖維相交形成格線，其成分為血影蛋白（spectrin）。環行纖維的勁度大於縱行纖維，這有利於維持外毛細胞的柱狀形態，也利於細胞的縱向伸縮。
3．細胞質膜 透射電鏡顯示外毛細胞外側壁的質膜呈凹凸不平的褶疊狀，類似百褶裙的褶疊。在其他需要改變形狀的細胞，其細胞質膜也呈褶疊狀，說明這是細胞改變形狀所需的共同特徵。外毛細胞外側壁的質膜含有很密集的跨膜蛋白，約占膜面積的70%～75%。冰凍蝕刻技術證明這些跨膜蛋白的直徑約為10 nm，分布密度可高達4500個/µm。這些跨膜蛋白就是與外毛細胞電致運動有關的動力元件，稱為動力蛋白，即前面提到的“prestin”。早在1991年Dallos等就提出電致運動可能是膜上一些對電壓敏感的蛋白構型發生改變所致，後來發現跨膜蛋白的出現及密度變化與外毛細胞電致運動的出現及發育過程恰好一致。prestin的發現和確認證實了外毛細胞的電致運動來自這些動力蛋白。
二、外毛細胞電致運動的特點
哺乳類動物外毛細胞的胞體有兩種主動運動方式：一種為受細胞膜電位控制的胞體長短的快速變化，即“電致運動”，其伸縮運動的頻率可高達幾萬赫茲，涵蓋了耳蝸的聽覺範圍，這是耳蝸主動機制（“耳蝸放大器”）的功能基礎。這種快速運動只取決於膜電位的變化，亦即受控於外毛細胞的感受器電位，而與通過外毛細胞的換能電流大小無關，也不依賴於胞內的ATP。胞體伸縮運動的幅度可達細胞長度的5%，這種長度變化所產生的力量可推動數倍於外毛細胞自身的質量，電刺激後出現胞體伸縮運動的延遲約在100微秒以內。外毛細胞胞體的長短變化與肌細胞最主要的不同之處在於它是雙向運動。當基底膜的機械運動使外毛細胞頂部的纖毛向長纖毛一側擺動時，細胞膜去極化, 胞體縮短；而纖毛向相反方向擺動時，外毛細胞膜電位出現超極化，胞體伸長。外毛細胞胞體的這種伸縮運動產生的機械力可通過支持細胞傳遞到基底膜，使基底膜的機械振動得到額外的能量。外毛細胞的另一種活動為胞體長短和直徑的緩慢變化，由耳蝸內多種神經活性物質調控，其作用可能是通過改變外毛細胞與蓋膜之間的機械耦合關係而調節耳蝸的聽敏度。
外毛細胞的電致運動呈不對稱性和非線性，這與毛細胞感受器電位的表現相一致。不對稱性表現為收縮運動的幅度比伸長運動的幅度要大得多；非線性表現為細胞長度的變化在刺激強度較大時出現飽和。一般認為，外毛細胞電致運動的不對稱性和非線性來自纖毛在剪下運動時擺動的不對稱性和非線性，這種反應的特點是聽覺的高度靈敏及巨大的動態範圍的基礎。
三、外毛細胞電致運動的機制
目前已普遍接受prestin為外毛細胞電致運動的動力蛋白，認為prestin在外毛細胞膜電位變化時發生分子構型的變化是電致運動產生的原因。從功能上看prestin可分為兩部分，一個是電壓感受器部分，另一個是效應器部分。Oliver等（2001）的研究表明，prestin通過細胞內以氯離子為主的單價陰離子感受電壓的變化：在去極化時，氯離子移向prestin的胞漿側，與prestin內側端的陰離子結合位點相結合，使prestin處於短構型，胞體收縮；在超極化時，氯離子移向prestin的胞外側，與prestin外側端的陰離子結合位點相結合，使prestin處於長構型，胞體伸長。Rybalchenko和Santos-Sacchi（2003）發現胞外氯離子可通過機械牽拉敏感性通道進入胞內，提示細胞外氯離子濃度對維持外毛細胞電致運動有重要作用。我們的研究也發現降低細胞外氯離子濃度並通過離子透析降低細胞內的氯離子濃度會明顯抑制耳蝸放大器的功能（Zheng et al，2005）。
電致運動的另一種產生機制為“壓電效應”。在壓電晶體，機械力作用於其上能產生電能，反之，電場的作用能使晶體發生變形、產生機械力。同樣，外毛細胞外側壁也具有“壓電”特性，在電場的作用下通過其本身的壓電特性能產生機械運動，這種壓電效應不受胞膜的容抗-阻抗所形成的低通濾波特性的限制，因此能產生高頻的機械運動。
耳蝸放大器工作原理
耳蝸放大器的理論是在“行波學說”和“電池學說”的基礎上，引入了外毛細胞電致運動的機制而形成的。目前一般認為耳蝸放大器的工作原理如下：聲音通過鼓膜和聽骨鏈的振動引發了基底膜行波，使蝸隔的上下振動從蝸底向蝸頂方向傳至對聲音頻率反應最大的部位。由於基底膜和蓋膜上下振動的支點不同，因此在螺鏇器網狀板與蓋膜之間就出現了剪下運動，使外毛細胞纖毛髮生沿內外方向的擺動而產生感受器電位，後者通過外毛細胞側膜的快動蛋白（prestin）使外毛細胞發生沿胞體縱軸的伸縮運動，這種運動跟隨聲音的周期，能夠產生足夠大的機械力作用於基底膜上，使與刺激聲頻率相應的基底膜上最佳反應部位（即基底膜行波的波峰）附近的振動得到加強，這樣就相當於將聲音放大；同時，基底膜振動的調諧也能變得非常尖銳。耳蝸放大器的這種工作原理在蝸隔上形成了一個“機械→電→機械”的正反饋環路，能夠有效地克服基底膜振動的阻尼並使振動增強。耳蝸放大器的工作有明顯的頻率和強度特性，即僅放大與刺激聲頻率相應的最佳反應部位附近的基底膜振動，而且主要對低強度聲有放大作用（可放大40 dB以上），隨刺激聲強度增高，放大作用逐漸減弱。這樣，耳蝸放大器不僅大大提高了耳蝸對閾值附近聲音的感受能力，提高了耳蝸的頻率分辨能力，也擴大了耳蝸對聲音強度的感受範圍。從以上描述我們看到耳蝸放大器對不同強度的聲音其放大係數不同，是一個非線性系統，因此，耳蝸的反應必然具有非線性系統的特性，如輸入-輸出函式曲線的非線性、兩音抑制現象、兩音或多音的相互調製畸變等。Liberman等（2002）發現prestin基因敲除小鼠的外毛細胞沒有了prestin的表達，其離體外毛細胞失去電致運動能力，儘管纖毛的機械敏感通道功能正常，但代表耳蝸主動機制的耳聲發射消失，聽力損失40dB以上，證實了prestin對活體耳蝸聽覺的重要作用。
外毛細胞電致運動所產生的機械力要傳遞給支持細胞和基底膜，要求外毛細胞必須具有一定的勁度。何志洲等的研究發現外毛細胞的勁度與膜電位和prestin 的構型變化緊密相關，去極化時外毛細胞的勁度下降，而超極化時外毛細胞的勁度增大，這種電壓依賴性勁度變化源自prestin的構型變化（He & Dallos，1999；He et al, 2003）。
外毛細胞纖毛主動運動
對外毛細胞纖毛主動運動研究的歷史與對胞體電致運動研究的歷史幾乎一樣長。早在1982年，Weiss就提出電壓變化能夠引起纖毛運動。Crawford 和 Fettiplace（1985）隨後報導了龜聽器毛細胞纖毛的主動運動。Kim（1986）於是提出耳蝸有兩種主動機制模型，即纖毛負責快運動，胞體負責慢運動。Howard和Hudspeth（1987）發現了蛙前庭毛細胞纖毛主動運動的“適應”機制。Jaramillo和Hudspeth（1991）報導纖毛主動運動與Ca有關。Martin和Hudspeth在1999年提出纖毛主動運動能夠放大機械刺激引起的反應。Manley等（2001）報導了蜥蜴耳蝸電刺激誘發的耳聲發射。但是，上述研究所用動物的聽器結構與哺乳類動物的耳蝸有很大的不同，最主要的是，其聽器的外毛細胞胞體不具備電致運動能力。
2003年，Fettiplace實驗室的Kennedy等報導了大鼠外毛細胞纖毛上的機械-電換能通道活動的快適應現象。他們用新設計的壓電晶體激發器刺激大鼠外毛細胞纖毛束，並記錄由此誘發的外毛細胞機械換能電流，發現該電流在出現後迅速衰減，即對刺激的“適應”，這一時程約在150微秒左右。相對於已經發現的由肌球蛋白介導的時程在10～100毫秒的“慢適應”，他們觀察到的上述適應過程是“快適應”。他們進一步發現這一快適應過程是由Ca介導的。由於在非哺乳類的低等脊椎動物已經證實由Ca介導的毛細胞機械換能通道活動的快適應是纖毛主動運動的產生機制，因此大鼠外毛細胞纖毛上的機械-電換能通道活動的快適應現象提示哺乳類動物的耳蝸也存在著毛細胞纖毛的主動運動。隨後，Corey 等 （2004）報導瞬間受體電位A1（transient receptor potential A1，TRPA1）是外毛細胞機械-電換能通道的候選蛋白，這一“發現”當時非常激動人心，但其結果很快就被否定，因為在TRPA1基因敲除的小鼠聽力完全正常。Chan和Hudspeth（2005）設計了一個模擬正常耳蝸螺鏇器離子和電環境的新鮮螺鏇器鋪片標本，並報導了Ca介導的豚鼠耳蝸毛細胞纖毛的主動運動。但他們觀察的是內毛細胞而非外毛細胞的纖毛，而且其數據的非線性特徵也似是而非，因此其實驗結果的可靠性存在疑問。賈淑萍和何志洲（2005）使用不同的新鮮螺鏇器鋪片標本和半切耳蝸製備，結合外毛細胞電位鉗制技術，觀察了不同條件下沙鼠外毛細胞纖毛的運動，認為外毛細胞纖毛的主動運動依賴於胞體的電致運動。但有人認為他們的實驗設計也存在缺陷，未能將纖毛的運動與外毛細胞的整體運動區分開來。2005年，Kennedy 和Fettiplace在《自然》雜誌上報導了與機械-電換能通道活動的快適應現象相應的、由Ca介導的大鼠外毛細胞纖毛的機械運動，並測量到纖毛運動所產生的機械力可達500pN以上。這是迄今為止最為直接和令人信服的關於哺乳類動物外毛細胞纖毛主動運動的實驗證據。
但是，要確認外毛細胞纖毛的主動運動在耳蝸放大器中的作用，還需要從活體動物實驗取得證據。Liberman等（2004）使用prestin 基因敲除小鼠，試圖通過測量耳蝸微音器電位和耳聲發射而尋找外毛細胞纖毛主動運動的證據，但其實驗結果未能提供清晰的線索。
總之，迄今為止，關於哺乳類動物耳蝸放大器的工作機制在觀點上和研究上形成了兩大陣營，一派是從事外毛細胞胞體電致運動的研究者，他們堅持外毛細胞胞體的電致運動是耳蝸放大器的唯一動力來源，因為胞體的組織結構和其電致運動所產生的力量使得對其機械反饋的能力毋庸置疑；另一派是從事纖毛主動運動的研究者，他們雖然承認胞體電致運動的存在，但認為纖毛的主動運動是耳蝸放大器的主要動力來源，而胞體的電致運動只是協助調整纖毛的位置，使之處於最佳的工作狀態。他們的理由是，胞體外側壁的容抗和阻抗所造成的低通濾波特性限制了胞體的高頻電致運動，使胞體的電致運動在1000～2000 Hz 以下的頻率才能發生，而纖毛的電致運動不存在低通濾波的問題，其運動頻率可高達數萬赫茲。客觀地說，上述兩派的觀點都過於偏激。筆者傾向於認為，胞體的電致運動和纖毛的電致運動在哺乳類動物耳蝸同時存在，但前者應占主導地位，而後者起輔助和協調的作用，它們的協同工作賦予了耳蝸靈敏的聽覺感受能力、精細的頻率分辨能力和寬廣的聽覺動態範圍。
