置換色譜

置換色譜(d isp lacem en t ch rom atog rap hy) 作為一種非線性色譜技術, 是指樣品輸入色譜柱後, 用一種與固定相作用力極強的置換劑(d isp lacer) 通入色譜柱, 去替代結合在固定相表面的溶質分子。樣品在置換劑的推動下沿色譜柱前進, 使樣品中各組分按作用力強弱的次序, 形成一系列前後相鄰的譜帶, 並在置換劑的推動下流出色譜柱。與其它色譜技術相比, 置換色譜有明顯的優點, 即上樣量大、產率高、解析度好, 而且易於操作。同時, 被分離樣品在分離過程中會自行濃縮。因此, 這一技術已越來越引起人們的關注。尤其對於生物產品, 由於其初始濃度非常低, 並與其它物質混處在同一複合物基質中, 而且在分離過程中要求仍然保持其生物活性, 所以將置換色譜技術套用於生物分子的製備性分離與純化, 有著其它色譜技術不可替代的優勢.
1. 分離機理
置換色譜是一種非線性色譜技術, 進樣量大, 進樣濃度較高。操作程式包括色譜柱的平衡、上樣、加置換劑、洗脫、分步收集和色譜柱再生這一系列過程。樣品的分離是由於被吸附組分之間對固定相吸附部位直接競爭作用的結果, 吸附較強的組分置換吸附較弱的組分, 並推動其向前移動。系統達到平衡後, 樣品中各組分按照它們對固定相親合力的大小形成一系列毗鄰的樣品區帶, 即置換序列(disp lacem en t train) , 並在置換劑的推動下以相同的速度向前移動。當樣品中各組分全部流出, 置換劑的前沿抵達色譜柱的出口時, 便完成了置換分離過程。色譜柱經再生處理, 就可以進行下一次操作。
2. 置換展開方式的優點與局限
雖然傳統洗脫色譜和置換色譜的分離作用都是由於樣品對固定相的作用力不同來實現的, 但兩者的分離機理不同[ 4 ]。洗脫色譜中, 樣品各組分的分離是由於它們對固定相作用的平衡常數不同, 導致各組分隨流動相的流動有不同的移動速度。改變流動相的組成、離子強度或pH 值可以改變樣品的吸附特性, 從而達到組分分離的目的。當樣品各組分的吸附特性不同時, 洗脫色譜是簡單而有效的。但當被分離的物質極相似時, 使用洗脫方式就很難使它們分離完全。同傳統的洗脫色譜方式相比, 置換展開則有如下優點: (1) 允許上樣量比洗脫色譜高得多, 儘管如此, 在置換分離過程中, 被分離組分仍能以相當高的純度獲得高產率; (2) 各組分在分離過程中能形成較清晰的界限, 消除了洗脫分析中的拖尾現象, 提高了樣品組分的回收率; (3) 產物濃度的可控性;(4) 需要較少的溶劑; (5) 與親和色譜不同, 可同時分離純化幾種物質。同製備色譜中其它兩種常用的展開方式, 超載洗脫(overloading elution) 和前沿分析(frontal analysis) 相比, 該技術的特殊優點是: 一旦找到合適的分離條件, 樣品中各組分的濃度在分離過程中會逐漸提高到操作線對應的濃度, 而且單位柱長的固定相利用率最高。
二、影響置換色譜分離的因素
1. 置換劑
(1) 置換劑的選擇　置換劑的選擇是置換色譜能否成功地分離和純化目標產物的關鍵因素之一。
理想的置換劑必須符合以下條件:
●與樣品中其它組分相比, 對固定相的吸附力最強, 而且呈現L angm u ir 吸附行為;
●化學穩定性好, 不與樣品中任何組分發生反應;
●易溶於流動相, 且能快速完成色譜柱的再生;
●易得到高純度的產品, 因為置換劑中的雜質可能污染樣品且增加色譜柱再生的難度;
●若分離後的產物混有置換劑, 置換劑應較易除去;
●無毒, 以符合藥用及食用生物產品的法規要求
2. 固定相
理想的固定相應具備以下條件:
●樣品及置換劑在固定相上應有較強的吸附作用, 且吸附是可逆的;
●樣品及置換劑在固定相上的吸附等溫線應為L angm u ir 型;
●樣品各組分在固定相上的吸附能力應有較大差別, 以保證置換色譜帶的交疊部分儘可能小而獲得良好的產率;
●有較好的化學穩定性, 可適用於不同pH 值的緩衝液和有機溶劑;
●有較大的比表面及吸附容量;
●有較好的機械強度, 而且容易再生。
3. 流動相
作為置換色譜的流動相與所採用的固定相有很大的關係。流動相對樣品應有足夠大的溶解度, 以免樣品溶液在分離過程中被逐漸濃縮, 超過飽和溶解度而發生沉澱。另外, 所選擇的流動相應有較好的化學穩定性、低粘度、低毒性且較易和樣品分離。傳統上, 人們都是參考前人的工作及反覆試驗來選擇合適的流動相, H uang[ 55 ] 等人則提出了用溶度參數的方法預測樣品在溶劑中的溶解度及分子間的相互作用力和親合力, 以篩選合適的流動相。Ho rvath等在流動相中加入添加劑或改性劑, 可以改變樣品組分的保留行為, 提高多組分置換色譜的分離效果。在一定的條件下, 將有機改性劑加在流動相中對產量的影響與增加置換劑濃度有相似的結果。此外,
在離子交換置換色譜中, 流動相中鹽的濃度對置換劑的置換效率和樣品分離度都有影響 , 其中,流動相中鹽的濃度對高分子量置換劑影響不大, 而低分子量置換劑宜選用高鹽濃度的流動相。
4. 非Langm u ir 型等溫線對置換行為的影響
置換色譜要求吸附等溫線應是L angmuir 型,但是許多生物分子對吸附劑的吸附作用是不相同的, 有些並不呈現L angm u ir 型, 而且不同物質在同一吸附劑上的吸附等溫線有時是交叉的, 這時置換色譜的分離情況就顯得較為複雜, 有時甚至根本無法分離。