紅細胞凝集試驗

指紅細胞凝集的現象。有由病毒、細胞凝集素和抗體而引起的紅細胞凝集。（1）由病毒而引起的凝集：G．H．Hirst（1941）發現流感病毒能使雞的紅細胞發生凝集，其後又發現其它各種病毒也能引起同樣的紅細胞凝集反應。即紅細胞表面存在著對各種病毒的受體，病毒與受體結合，以紅細胞為橋樑的結果而引起凝集。利用此反應可以進行病毒的定性和定量。另外，如果存在抗病毒的抗體時，則由病毒引起的凝集作用將被抑制，所以可用於抗病毒抗體的檢出。（2）由抗體引起的凝集：（a）如果存在對紅細胞表面決定基的抗體，則紅細胞亦將凝集。可用於測定對抗紅細胞的抗體的效價或鑑定人的血型。（b）在紅細胞表面，如果人為地使之吸附或結合特定的抗原物質，則與該抗原相對應的抗體將引起紅細胞凝集（被動凝集反應或間接凝集反應，psssive he-magglntination）。
血凝及血凝抑制試驗
有些病毒具有凝集某種(些)動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設計的試驗稱血球凝集(HA)試驗，以此來推測被檢材料中有無病毒存在，是非特異性的，但病毒的凝集紅細胞的能力可被相應的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗，具有特異性。通過HA-HI試驗，可用已知血清來鑑定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應抗體和滴定抗體的含量。
[目的要求]
掌握病毒HA和HI試驗的原理和基本操作方法，了解其實用價值。
[材料與試劑]
1. 96孔“U”形或“V”形微量反應板，50 uL定量移液器，滴頭，微型振盪器。
2. 生理鹽水，0.5%雞紅細胞懸液，新城疫病毒液（尿囊液或凍乾疫苗液），新城疫陽性血清，被檢雞血清。
[實驗內容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)試驗
1. 在96孔微量反應板上進行，自左至右各孔加50 uL生理鹽水。
2. 於左側第1孔加50 uL病毒液（尿囊液或凍乾疫苗液），混合均勻後，吸50 uL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50 uL；第12孔為紅細胞對照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細胞懸液50 uL，在振盪器上振盪，室溫下靜置後觀察結果（表4-1）。
表4-1 病毒血凝試驗的操作方法（單位：uL）

孔 號	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
病毒稀釋度	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	1:2048	對照
生理鹽水	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
病毒液	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
0.5%紅細胞	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
棄50
結果觀察	++++	++++	++++	++++	++++	++++	​	+++	+	+	-	-

4. 結果判定：從靜置後10 min開始觀察結果，待對照孔紅細胞已沉澱即可進行結果觀察。紅細胞全部凝集，沉於孔底，平鋪呈網狀，即為100% 凝集（++++），不凝集者（-）紅細胞沉於孔底呈點狀。
以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位。從表4-1看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個血凝單位，或將128/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。
(二) 血球凝集抑制(HI)試驗
1. 根據HA試驗結果，確定病毒的血凝價，配製出4個血凝單位的病毒液。
2. 在96孔微量反應板上進行，用固定病毒稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加50 uL生理鹽水。
3. 第1孔加被檢雞血清50 uL，吹吸混合均勻，吸50 uL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50 uL，稀釋度分別為：1:2、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫陽性血清50 uL，作為血清對照。
4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4個血凝單位的新城疫病毒液，其中第11孔為4單位新城疫病毒液對照，振盪混合均勻，置室溫中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 雞紅細胞懸液50 uL，振盪混合均勻，室溫下靜置後觀察結果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制試驗的操作方法（單位：mL）

孔 號	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
血清稀釋度	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	病毒 對照	血清 對照
生理鹽水	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	​
被檢雞血清	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	​	50
4單位病毒	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
室溫中靜置 10 min
0.5%紅細胞	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
棄去50
結果觀察	-	-	-	-	-	-	+	++	+++	++++	++++	-

6. 結果判定：待病毒對照孔（第11孔）出現紅細胞100%凝集（++++），而血清對照孔（第12孔）為完全不凝集（-）時，即可進行結果觀察。
以100%抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。
從表4-2看出，該血清的HI效價為1:64，用以2為底的負對數(-log2)表示，即6log2。
附錄
1. 阿氏液（Alsever）：即紅細胞保養液
枸櫞酸鈉（5H2O） 0.80g
枸櫞酸（H2O） 0.055g
葡萄糖 2.05g
氯化鈉 0.42g
雙蒸水 加至 100 ml
將以上試劑加熱溶解於雙蒸水中，調整pH至6.8，115℃滅菌10min,4℃保存備用。
2. 0.5% 雞紅細胞製備方法
先用滅菌注射器吸取3.8% 枸櫞酸鈉溶液(其量為所需血量的1/5)，從雞翅靜脈或心臟採血至需要血量，置滅菌離心管內，加滅菌生理鹽水為抗凝血的2倍，以2000r/min離心10min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉澱，如此將紅細胞洗滌三次，最後根據所需用量，用滅菌生理鹽水配成0.5%雞紅細胞懸液。
3. 96孔微量反應板的清洗
將浸泡有75%乙醇的棉簽放入微量反應板的每個孔內鏇轉，用自來水沖洗反應板5次，再用蒸餾水沖洗3次以上，置37℃溫箱中乾燥。