糖原
糖原(glycogen)又稱肝糖,以顆粒形式存在於肝細胞(肝糖原)和肌肉(肌糖原)中。它是經一系列酶催化反應,將多個葡萄糖組合而成的分支多糖,其功能與植物的澱粉相似,所以又叫動物澱粉。糖原是動物的儲備多糖,當生物體一旦不能從外界獲得營養物質時,儲存糖原就可在酶的作用下,釋放出葡萄糖以供生物體能量消耗的需要。
糖原為無定形粉末,不溶於冷水,易溶於熱水,其水溶液遇碘顯棕紅色。糖原能被α一澱粉酶水解。與支鏈澱粉類似,糖原也是由α-D-葡萄糖通過α-1,4-苷鍵和α-1,6-苷鍵連線成的多糖。糖原分支程度更高,支鏈更多、更短,每隔8~10葡萄糖殘基就有一個支鏈,相對分子質量高達1×10 。
糖原中葡萄糖殘基的轉換
糖原存在於如肝臟和骨髂肌這些組織內的微小顆粒中;這些顆粒也含有緊密結合的糖原磷酸化酶和糖原合成酶。肝糖原的葡萄糖殘基進行經常的非常快的轉換,因為大量的葡萄糖和其它己糖從小腸到達肝臟,在經過暫時地以糖原貯存後,又再以血糖的形式離開肝臟。並非糖原的高度分支結構的所有部份都以同樣的速率轉換。大多數葡萄糖殘基的轉換髮生在外周分支,而糖原的核心結構代謝較為穩定,其轉換速率很低 。
膠體金標記的外源凝集素反應示糖殘基
1、原理
糖內的各種糖殘基具有與膠體金標記的外源凝集素(lectin)特異性結合的特性,因而糖殘基可得到顯示。本法是Roth(1983)建立,村田長芳(1985)改進的。
2、試劑配製
(1)磷酸緩衝等滲氯化鈉液(pH7.4) (PBS):氯化鈉0.9g,溶於磷酸緩衝液100ml中。
(2)膠體金標記的外源凝集素溶液:按凝集素25~50μg/ml的濃度用PBS配製。外源凝集素的種類較多,伴刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)、蓖麻凝集素(ricinus communis agglutinin—Ⅰ,RCA—Ⅰ)、花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)、麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)、荊豆凝集素(ulex europeus,UEA—Ⅰ)等。
3、步驟
(1)新鮮的小片組織(大小為0.5~1mm 左右)放入0.5%或1%戊二醛磷酸緩衝等滲氯化鈉溶液(pH7.4),或者2%多聚甲醛(paraformaldehyde)PBS一0.1%戊二醛PBS等量混合液(pH7.4),4℃乃至室溫下固定2~3h之後,必要時再入0.5%氯化銨PBS液中,室溫下作用2h,以封閉游離的醛基。組織片用LowicrylK4M進行低溫包埋,製作超薄切片,撈到貼有formvar支持膜的鎳網上。
(2)PBS洗5min。
(3)0.2%~1%牛血清白蛋白PBS溶液中處理5min。
(4)PBS充分洗。
(5)膠體金標記的外源凝集素溶液中,室溫下反應30~60min。
(6)PBS洗2次。各3~5min。
(7)蒸餾水洗。
(8)醋酸鈾染色5min。
(9)乙酸鉛染色2min。
(10)蒸餾水洗。
(11)鍍碳。
4、結果
α—D一甘露糖、α—D一葡萄糖(Con A),β—D一半乳糖(RCA—Ⅰ),N一乙醯一D一半乳糖胺(PNA),N一乙醯一D一葡糖胺(WGA),α—L一岩藻糖(UEA—Ⅰ)等的殘基上有膠體金粒子存在。對照為陰性
5、注意事項
(1)包埋用樹脂,Epon812也可以用,但糖殘基的檢出率極低,效果甚差。
(2)Lowicryl K4M對電子射線的抵抗力弱,步驟(11)鍍碳是為了增強其抵抗力。
(3)為確定本反應對各種糖殘基是否是特異的,應做必要的對照。其方法是在步驟(5)使用的膠體金標記外源凝集素溶液中,分別加入0.1~0.15mol/l。濃度的各自的單糖,然後進行(6)以下各步驟之後,其結果如反應變成陰性則可認為本法是特異的。
(4)本法是直接標記法。還有間接標記法:切片先與未標記的外源凝集素反應,PBS洗,然後再與膠體金標記的糖蛋白(過氧化物酶、卵類粘蛋白等)反應,PBS洗後,蒸餾水洗淨,乙酸鈾、乙酸鉛雙染色,效果也好 。