分類
按Osbron的分類方法,米糠蛋白可分為如下四類:清蛋白(Albumin),可溶於水的蛋白質;球蛋白(Globulin),去除清蛋白,可溶於稀鹽溶液的蛋白質;醇溶蛋白(Prolamin),去除清蛋白和球蛋白後,可溶於70%乙醇的蛋白質;谷蛋白(Glutelin),去除上述三種蛋白後,可溶於稀酸或稀鹼的蛋白質。據資料報導,米糠中4種蛋白質的比例大致為37∶36∶5∶22。與傳統的鹼法提取蛋白質相比,酶法提取米糠中的蛋白質具有時間短、反應條件溫和且不易產生有害物質等優點。
提取方法
材料與儀器
米糠、纖維素酶、正己烷、氫氧化鈉、濃硫酸、氯化鈉、乙醇、硼酸、硫酸銅、鹽酸、硫酸鉀等 均為分析純。
低速離心機LD 4- 2A型;DHG- 9240A型電熱恆溫鼓風乾燥箱;HVP-Ⅱ型消化爐;KDN- 0413凱氏定氮儀;pHS- 3C型精密pH計;HHS21- 4電熱恆溫水浴鍋;JJ-l電動攪拌器;電子分析天平。
實驗方法
原料中主要成分的含量測定
蛋白含量測定 凱氏定氮法(GB/T5009.3-2003)。
蛋白質提取率的計算
米糠蛋白提取率(%)=提取物中蛋白質的量/原料中蛋白質的量× 100%
脂肪含量的測定 索氏抽提法(GB/T5009.6- 2003)。
水分含量的測定 恆重法(GB/T5009.4-2003)。
纖維含量的測定 重鉻酸鉀-碘量法。
脫脂米糠的製備 原料米糠經粉碎,過80目篩子,向過篩米糠中以1∶10的比例加入正己烷,室溫下攪拌30min,3000r/min離心l0min,沉澱在室溫下晾乾,即得脫脂米糠。
米糠水解工藝 脫脂米糠→加水(配成固液比1∶10)→攪拌調適當的pH,溫度(依條件而定)→加酶→反應一定時間(期間加1mol/L HCl、1mol/L NaOH,維持pH在± 0.05之間)→離心(3000r/min、20min)→滅酶(調pH = 8,80℃ ,10min)→沉澱(待用)清液→收集上清液V。
米糠蛋白進一步提取處理 由於米糠中的蛋白質包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,它們分別具有不同的溶解特性,可以採用不同的溶劑對其進行後處理,從而提高蛋白質的收率。經水解後的水解液偏酸性,主要含有清蛋白,其餘蛋白質有待進一步從殘留物中提取出來。
影響因素
溫度
在pH 4.3,酶添加量為90U/g的條件下提取1h,測定脫脂米糠的蛋白收率。以蛋白回收率為指標,考察提取溫度與脫脂米糠蛋白提取率的關係。隨著溫度的升高,米糠蛋白收率不斷增加,50℃時蛋白收率最大,達到56.38%,這主要是由於溫度升高,蛋白質溶解度增大的結果;超過50℃蛋白收率開始降低,原因可能是由於提取溫度過高造成部分纖維素酶失活及米糠蛋白變性。
時間
在pH 4.3,45℃ ,酶添加量為90U/g的條件下,分別測定不同提取時間下脫脂米糠的蛋白收率,考察提取時間與脫脂米糠蛋白提取率的關係。隨著提取時間的延長,脫脂米糠中蛋白的收率不斷增加。在1～ 2.5h之間,隨著提取時間的延長,蛋白收率明顯增加;但是,在2.5h後,蛋白收率隨著提取時間的延長增加緩慢。其原因可能是在提取時間達到2.5h時,米糠蛋白已經基本接近此條件下溶出的極限。從經濟及效益兩方面考慮,提取時間選取2.5h為宜。
PH
固定在45℃ ,酶添加量為90U/g,提取時間1h的條件下,測定脫脂米糠的蛋白收率。以蛋白回收率為指標,考察提取pH與脫脂米糠蛋白提取率的關係。在pH 4～ 4.8範圍內,隨著pH升高,蛋白質的提取率升高,在pH為4.8時,達到最高峰,pH繼續升高,蛋白質的提取率反而下降,說明纖維素酶提取米糠蛋白的適宜pH為4.8
維素酶含量
在提取時間1h,溫度45℃ ,pH 4.3不變的前提下,改變反應體系中的酶添加量,考察酶添加量與脫脂米糠蛋白提取率的關係,在酶添加量為90～ 270U/g時,隨著酶添加量的增多,蛋白收率增大,酶添加量繼續增大,蛋白收率開始下降,當酶添加量為270U/g時,達到最高峰,說明此纖維素酶的最適酶添加量為270U/g。
