固氮反應條件
儘管能固氮的微生物多種多樣，但各類固氮微生物進行固氮的基本反應式相同，即
N+6e +6H +nATP→2NH+nADP+nPi
此反應很清楚地表明要進行固氮，必須滿足以下基本條件 ：
（1）必須有具固氮活性的固氮酶。
（2）必須有電子和質子供體，每還原1分子N需要6個電子和6個質子，另有2個質子和電子用於生成H。還需有相應的電子傳遞鏈傳遞電子和質子。
（3）必須有能量供給，由於N分子具有鍵能很高的三價鍵，因此需要很大的能量才能打開。
（4）有嚴格的無氧環境或保護固氮酶的免氧失活機制，因為固氮酶對氧具有高度敏感性，遇氧即失活。
（5）形成的氨必須及時轉運或轉化排除，否則會產生氨的反饋阻抑效應。
固氮酶
結構組成
儘管自然界中固氮微生物多種多樣，但固氮微生物所含固氮酶組成大致相似，都是由兩個亞單位（即組分IMoFe蛋白、組分IIFe蛋白）和一個輔因子（FeMoco）組成。目前已知自然界中存在三套含有不同金屬的固氮酶，即在環境中無Mo時可被V代替，但多數固氮微生物所含的是鉬鐵蛋白固氮酶，而且以鉬鐵蛋白固氮酶的固氮效率為最高。來自不同固氮微生物固氮酶的兩個亞基之間可以進行互補，組成的固氮酶仍然具有固氮活性，但這種活性比各自原始的固氮酶活性要低。
催化特徵
固氮酶除了能催化N還原為NH外，還可催化還原下列物質：催化CH為CH，2H為H，N為NH和N，催化NO為N和HO，等等。可見，固氮酶是一個十分活躍、基質譜相當廣的酶。但在所有能催化的基質中，以催化N為NH的反應效率最高。
催化機理
在固氮過程中，由呼吸作用、發酵光合作用過程中產生的電子和質子首先還原NAD或NADP成為NADH或NADpH，由還原態的NADH或NADpH還原Fd或Fld，再還原固氮酶組分Ⅱ即鐵蛋白，由還原態的鐵蛋白還原固氮酶組分Ⅰ即MoFe蛋白，還原態的MoFe蛋白還原N和其他各種底物。固氮酶合成、催化和酶活性調控的分子生物學研究已經相當深入，固氮酶合成的各個基因結構及其功能已大多清楚。固氮酶nif基因簇表達在有氧和高濃度有效氮素因素下的調控機理也已闡明。
影響效率因素
（1）氧對固氮酶的影響
固氮酶對氧氣敏感，從好氧固氮菌體內分離的固氮酶，一遇氧就發生不可逆性失活。固氮酶對氧氣敏感，從好氧固氮菌體內分離的固氮酶，一遇氧就發生了不可逆失活。好氧固氮菌生長需要氧，固氮卻不需要氧。好氧固氮菌為了生長過程中同時固氮，它們在長期的進化中形成了保護固氮酶的防氧機制，使固氮作用正常進行。
（2）固氮作用中的氨效應
氨的固氮作用的產物，但氨的數量超過了固氮微生物機體本身的需要並迅速轉換為胺基酸的能力較低時，積累的氨可阻遏體內固氮氨的生物合成。在缺乏NH 的環境裡，谷氨醯胺合成酶能與固氮啟動基因組合，推動RNA聚合酶催化轉錄mRNA，合成固氮酶。但在有豐富NH 的環境中，谷氨醯胺合成酶被腺苷化，構象發生變化，失去與固氮酶啟動基因區結合的能力，導致固氮酶不能合成。因此在培養固氮菌時如加入銨鹽，則固氮菌不進行固氮而依賴銨鹽生長。
（3）ADP/ATP比率對固氮酶活性的調節
在Mg 和ATP參與的情況下，固氮酶能催化N為NH，這是固氮酶活性不可缺少的成分和正效應劑。Mg·ATP的水解產物是Mg·ADP，但兩者的作用完全相反，Mg·ADP是固氮酶的負效應劑，對固氮酶的產物還原活性部位起負的別構調節作用。它可以抑制從鐵蛋白到鉬鐵蛋白的電子轉移，並控制進入鐵蛋白的電子總量，因而能有效地抑制固氮酶活性。因此細胞內ADP/ATP的比率可以調節固氮酶活性。
（4）環境中的C/N的影響
土壤中C/N是影響固氮作用的最重要的因素之一。化能異養型固氮微生物只有在環境中有豐富的有機碳化合物而同時又缺少化合態時才能進行有效固氮。如果環境中化合態氮十分豐富，固氮微生物利用現成的氮化物作氮源，而固氮酶被化合態氮抑制，不顯示固氮活性。另外，非固微生物由於氮源豐富而易於發展，因此與固氮微生物競爭碳源。因此只有在C/N比很高的環境中，這類化能異養型固氮微生物才會發揮固氮作用。
