液氮研磨

原理

分子生物學是當前生命科學領域的前沿學科,其理論與技術已滲透到各學科領域,而分子生物學實驗在生命科學研究中顯得相當重要。在實際工作中,許多實驗材料比如動物身上的肌肉組織、結締組織、骨組織、毛髮組織等,植物的根、莖、葉、種子等均需磨碎,隨後才能對其成分、基因與蛋白質及結構和功能進行研究。
液氮研磨在分子生物學實驗中套用廣泛,特別是有關核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)的分離。液氮的溫度為一196℃,它既能使各種組織成分不易被破壞或降解,又能使組織變硬,脆性增加易於磨碎。正是由於液氮的溫度極低,操作時要特別小心。液氮研磨，一是為了終止細胞內外一切生物反應，比如提取RNA時，防止RNA酶的降解反應等；還有一個原因，就是在液氮中的細胞完全凍硬了，研磨可以達到很好的破胞效果，將細胞磨成粉，使裡邊的物質釋放出來。

如何操作

液氮容器的準備

液氮一般保存於液氮罐中。實驗前先準備一個保溫桶,將適量液氮轉移至保溫桶中,同時還要準備一個不鏽鋼或塑膠湯勺,湯勺的柄不夠長時要想辦法加長,以免凍傷手。

組織的處理及用量

任何組織在獲得後如不立即使用,要儘快保存在低溫環境中(一196℃液氮中速凍,一70℃保存)。使用時,植物組織應當先用自來水清洗外表的泥沙,用單蒸水沖洗兩遍,用75%乙醇浸洗約30秒,再用滅菌雙蒸水沖洗兩遍,用無菌濾紙吸乾,然後根據需要取適當部位的組織。動物組織不必清洗,但要儘量剔除周邊的組織及血塊。組織的取量要比實際需要量大1一2倍,因為研磨時部分組織會粘在研缽和研棒上,會致部分組織樣本丟失

研缽的固定

我們在實驗時發現,研缽在加液氮後溫度很低,外表會形成許多冰晶,用力研磨組織時易打滑,研缽內的組織液氮混合物很容易濺出,造成組織丟失,也容易凍傷手。如果在研缽下墊些紗布或濾紙,雖不易滑動,但由於緩衝作用,研磨時不受力,不足取。後來我們作了如下改進:一是做個木支架,即選一塊厚約兩寸的木板,在上面挖個半球形圓洞(大小根據研缽大小而定),木板兩端留一定長度以備手握之用,使用時將研缽卡在半球形洞中,既穩當又不會凍傷手;二是備一條幹淨的毛巾或紗布(乾的),折成長條形,將研缽包圍起來,兩端合併後用手抓住,這個方法簡單實用,但要特別小心,以免凍傷。

研磨方法

空缽先用液氮預冷,再將研棒的上端用紗布包裹(用力時手不會痛),組織最好切成薄片,研磨時不易濺出,也更容易磨碎,研棒最好頂著手心,這樣便於用力。研磨過程中要避免液氮乾涸,研磨至細粉即可。待液氮剛蒸發完時,用一個小藥勺取出所需用量進行下一步實驗,或者將組織粉末裝人容器內,保存於一70℃的溫度下,以備下一步實驗用。使用得當的液氮研磨組織法,將為下一步實驗成功奠定了基礎。值得一提的是,操作中所有接觸的器皿及耗材須清洗乾淨並消毒。如果研磨組織用於提取RNA時,使用的器皿及耗材必須採用焦碳酸二乙醋(DEPC)滅活RNase並進行高壓消毒處理。

注意事項

把樣品放入研缽中，倒入少量液氮，液氮就會像沸騰了一樣，這時候迅速研磨。動作一定不要太大，最好是用手心的力量往下鏇轉著碾碎，動作太大會把樣品濺飛，如果樣品量很少直接就可能磨沒了。大約幾秒沸騰就結束，再磨幾下就可以再加入點液氮，重複以上過程，知道認為磨得比較細了為止。

液態氮在常壓時的溫度相當的低，一旦與物體表面接觸將迅速地沸騰，同時也會帶走相當大量的熱能。 因此，使用液態氮時須額外注意，避免與皮膚的直接接觸。

裝填時應穿戴護具，如：防凍手套。切忌使用棉質手套，棉質手套會藉由毛細現象吸著大量的液態氮而提高凍傷的可能性(甚至比不穿戴還要危險)。

研缽要用瓷質的，當然研杵也一樣，倒液氮的量要視你研缽的大小和實驗材料的量而定，建議你用小一點的研缽，這樣研磨的時候材料比較集中好研一點，液氮倒研缽體積的一半即可。