品名
微生態活菌製品總論
Weishengtai Huojun Zhipin Zonglun
Microecologics for Therapeutic Use
基本要求
微生態活菌製品的製備方法、工藝應能保證成品含有足夠的活菌數量，保持其穩定性，同時應防止外源因子的污染。
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
製造
生產用菌種應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定。
選用的生產用菌種應來自人體內正常菌群，或對人體無毒無害、具有促進正常菌群生長和活性作用的外籍細菌。細菌的分離過程和傳代背景應清晰，應具備穩定的生物學和遺傳學特性，並能保持穩定的活菌狀態，經實驗室和臨床試驗證明安全、有效。
生產用菌種應按照“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定建立種子批系統。三級種子批應分別凍乾，置適宜溫度保存；種子批傳代應限定傳代次數，原始種子批和主種子批啟開後傳代次數不得超過10代，工作種子批啟開後至發酵培養傳代次數不得超過5代。3．種子批的檢定
菌種的屬、種型分類鑑定，應依據最新版伯傑氏細菌系統鑑定手冊（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）和伯傑氏細菌命名手冊（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）的有關規定進行，包括形態、生長代謝特性檢查。原始種子或主種子還應做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。
原始種子和主種子應凍乾保存於8℃以下，工作種子應置於適宜溫度保存。
應包括種子液製備、大罐培養、收穫菌體（或芽孢）和菌體乾燥製成菌粉。如生產多價製品時，應每種菌分別培養，製備單價菌粉。
啟開工作種子批菌種，接種子適宜培養基進行多級種子擴增，應塗片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察5～10個視野，細菌的染色反應、形態應一致並符合原始菌種的特徵。製備過程應防止污染，菌種傳代次數應符合規定。
採用經批准的培養基用於生產。
採用液體培養。將種子液置適宜條件下培養（包括厭氧或需氧、溫度、時間等），培養過程中取樣塗片做革蘭氏染色鏡檢、pH值檢測等，芽孢菌需進行芽孢形成率的檢測，均應符合規定。培養結束後取樣做純菌檢查，如發現污染應予廢棄。
生產多價製品的單價菌粉時，應分別培養。
培養結束後離心收穫濕菌體，與適宜的分散劑、穩定劑混合。採用真空冷凍乾燥法乾燥菌體，芽孢菌可採用加熱乾燥方法，再經粉碎、過篩製成粉末狀菌粉。
應通過活菌穩定性試驗確定保存溫度和有效期。
按“菌粉檢定”項進行，符合規定後方可進行半成品配製。
同一工作種子批菌種生產的最多2批單價菌粉可按批准的比例與輔料混合均勻後製成半成品。配製多價製品時，應將各單價菌粉、輔料按配方比例和配製程式混合均勻，配製過程應防止污染。
按“半成品檢定”項進行，應符合規定。
根據製品的用途、使用對象和用藥途徑等因素確定劑型。製備過程應符合2010年版藥典三部附錄Ⅰ 製劑通則”項下相關劑型的規定。
成品批號應在半成品配製後確定，配製日期即為生產日期。同一批號的製品，應來源一致、質量均一，按規定要求抽樣檢驗後，能對整批製品作出評定。應根據驗證結果，規定半成品的分裝時間，如超過24小時，應分為不同的亞批。
製品的分裝應符合2010年版藥典三部附錄Ⅰ 製劑通則”的有關規定。包裝應符合“生物製品包裝規程”的有關規定。規格應符合批准的規格要求。
檢定
微生態活菌製品質量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定。
應為白色、灰白色或灰黃色粉末。
取少量菌粉加入適量滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液後，塗布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養，其培養物的生長特性和染色鏡檢的特徵應符合生產用菌種特徵。
方法和結果判斷見本總論附錄3。如不符合規定應廢棄。
菌粉中殘餘水分的含量會直接影響活菌的生存，須進行菌粉乾燥失重的檢查。應按2010年版藥典三部附錄Ⅶ L或儀器方法測定。
測定每克菌粉中含有的活菌數量。方法見本總論附錄2。
半成品須做雜菌檢查，根據用藥途徑確定雜菌檢查的質控指標。方法和結果判斷見本總論附錄3。
檢查成品中所含的目的菌是否符合生產用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進行生長特性、染色鏡檢和生化反應檢查，應符合規定。對於多價製品，則須逐一檢查單價菌特性。
根據劑型，觀察製品的外觀、色澤。
片劑外觀應完整、光潔，呈白色或類白色，間有菌粉色斑；顆粒劑、散劑和膠囊劑內粉末的粒子大小、色澤應均勻，間有菌粉色斑。
按2010年版藥典三部附錄Ⅶ L或儀器方法測定，減失重量應不得超過5.0%，芽孢菌製品應不得超過7.0%。
散劑和顆粒劑應進行粒度檢查。
按2010年版藥典三部附錄Ⅴ G第二法，採用單篩分法或雙篩分法檢查，應符合規定。
各劑型按2010年版藥典三部附錄Ⅰ 製劑通則”的相應規定進行，應符合規定。
膠囊劑、片劑按2010年版藥典三部附錄Ⅴ C進行，應符合規定。
按本總論附錄2方法測定每克製品中的活菌數，應符合規定。多價製品應分別測定各單價活菌數。
目的是檢查成品中外源微生物的污染情況，以保證人體使用安全。
方法和結果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。
安全試驗是通過動物試驗進行的非特異性毒性檢查，應根據製品的使用途徑和人用劑量確定試驗方法。
稱取2g製品，加入8ml生理氯化鈉溶液中，混合均勻。用5隻體重18～22g小鼠，每隻小鼠經口灌胃0.5ml，每天1次，連續3天。自第1天灌胃起，連續觀察7天，小鼠應健康存活、體重增加，判為合格。如不合格，可另選10隻小鼠複試1次，判定標準同前。
用24～26g雌性小鼠5隻，每隻小鼠陰道內置入10mg製品，每天1次，連續3天。自給藥第1天起，連續觀察7天，小鼠應健康存活、體重增加，陰道局部無紅腫、分泌物等症狀，判為合格。
保存和運輸
按批准的溫度保存和運輸。自生產之日起，按批准的有效期執行。
附錄
附錄1 已批准上市的微生態活菌製品
附錄2 微生態活菌製品活菌數測定法
附錄3 微生態活菌製品雜菌檢查法
附錄1已批准上市的微生態活菌製品
續表
附錄2微生態活菌製品活菌數測定法
無菌稱取3.0g製品或菌粉（膠囊取內容物），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，做10倍系列稀釋（最終稀釋度根據不同的指標要求而定）。取最終稀釋度的菌液100μl，滴人選擇性瓊脂培養基平皿上，共做3個平皿，並以玻棒塗布均勻，置適宜條件下培養，到期觀察每個平皿菌落生長情況，並計數。當平皿菌落數小於10或大於300時，應調整最終稀釋度，重新測定。根據3個平皿菌落總數按下列公式計算活菌數：
活菌數（CFU/g） =3個平皿菌落數之和/3×10×最終稀釋度
【附註】
（1）活菌數用“CFU”表示，即為細菌集落單位。
（2）稀釋液使用滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜的稀釋液。
（3）選擇性瓊脂培養基，是指最適宜製劑（或菌粉）中活菌生長的培養基。須經批准後方可使用。
附錄3微生態活菌製品雜菌檢查法
微生態活菌製品雜菌檢查法系檢查微生態活菌製品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。檢查項目包括控制菌檢查，非致病性雜菌、真菌計數。
雜菌檢查應在環境潔淨度10000級下的局部潔淨度100級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。
除另有規定外，本檢查法中細菌培養溫度為30～37℃；真菌培養溫度為20～28℃。
檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中隨機抽取不少於3倍檢驗用量的供試品。
菌粉、半成品以及成品為散劑和顆粒劑的可直接稱取備用；成品為片劑、膠囊劑的需研碎後備用。
控制菌檢查用的培養基，即成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配製的培養基，均應進行培養基的適用性檢查。檢查項目包括促生長、指示和抑制特性能力。
試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種為第-代），並採用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC （B） 44102]
金黃色葡萄球菌（Staphylacoccus aureus） [CMCC（B） 26003]
乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B） [CMCC （B） 50094]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） [CMCC （B） 10104]
生孢梭菌（Clostridium sporogenes） [CMCC （B） 64941]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC （F） 98001]
痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae） [CMCC （B）51252]
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，培養24～48小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數為10～100CFU或100～1000CFU的菌懸液。
菌懸液製備後應在2小時內使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時內使用。
續表
（1）增菌培養基促生長能力檢查 分別接種不超過100CFU的試驗菌於被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基比較，被檢培養基試驗菌應生長良好。
（2）固體培養基促生長能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數50～100CFU）分別塗布於被檢培養基和對照培養基平皿中，每種培養基平行製備2個平皿，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。被檢培養基與對照培養基相比，生長的菌落大小、形態特徵應一致。
（3）培養基抑制能力檢查 接種不小於100CFU的試驗菌於被檢培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最長時間下培養，試驗菌應不得生長。
（4）培養基指示能力檢查 分別接種不超過100CFU的試驗菌於被檢培養基和對照培養基平皿上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時間下培養。被檢培養基中試驗菌生長的菌落形態、大小、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。
供試品的控制菌檢查應按下述方法進行。
陽性對照試驗 供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。取陽性對照菌於相應選擇性培養基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養，觀察菌落生長情況。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。
陰性對照試驗 取增菌液0.1ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。
（1）增菌培養 稱取供試品1g，加到9ml滅菌膽鹽乳糖培養基中，培養18～24小時。
（2）特異培養 將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到曙紅亞甲藍瓊脂平皿上，以玻棒塗勻，一式3份，培養18～24小時，觀察菌落生長情況。
（3）結果判定 陽性對照平皿應長出紫黑色、圓形、稍凸起、邊緣整齊、表面光滑、帶有金屬光澤的菌落。供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照的菌落形態特徵不符，判供試品未檢出大腸埃希菌；若生長的菌落與陽性對照的菌落形態特徵相符或疑似，應做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑑定試驗，鑑別是否為製品中的目的菌或大腸埃希菌。
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC （B） 44102]
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC （B） 26003]
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC （B） 63501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC （F） 98001]
菌液製備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，培養24～48小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數為50～100CFU或500～1000CFU的菌懸液。菌懸液製備後應在2小時內使用，若保存在2～8℃的菌懸液可在24小時內使用。
適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液各1ml（含50～100CFU），分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基。每株試驗菌平行製備2個平皿，混勻，凝固，置30～37℃培養48小時，計數；取白色念珠菌液1ml（含50～100CFU），注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，混勻，凝固，置20～28℃培養72小時，計數．或採用塗布法，取上述菌液各0.1ml（含菌數50～100CFU），分別塗布於相應瓊脂培養基平皿上，以玻棒塗布均勻，一式2份，同法培養，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
結果判定 被檢培養基的菌落平均數與對照培養基的菌落平均數相比大於70%，且菌落形態、大小應與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。
照無菌檢查法（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）和微生物限度檢查法（2010年版藥典三部附錄Ⅻ G）中“培養基及其製備方法”的處方製備，未收錄的培養基可按照以下配方配製，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配製後，應採用驗證合格的滅菌程式滅菌。
雜菌檢查的限度標準是基於藥品的給藥途徑和對患者健康潛在的危害以及活菌製品的特殊性而制訂的。
金黃色葡萄球菌 每1g不得檢出。
銅綠假單胞菌 每1g不得檢出。
沙門菌及志賀菌 每1g不得檢出。
非致病性雜菌數 每1g不超過500CFU。
真菌數 每1g不超過100CFU。
（2）半成品、成品
大腸埃希菌 每1g不得檢出。
金黃色葡萄球菌 每1g不得檢出。
銅綠假單胞菌 每1g不得檢出。
沙門菌及志賀菌 每1g不得檢出。
非致病性雜菌數 每1g不超過1000CFU。
真菌數 每1g不得超過100CFU。
版本
《中華人民共和國藥典》2010年版
使用說明
應符合“生物製品包裝規程”規定和批准的內容。
