概述與原理
中文名稱多光子雷射掃描顯微鏡，英文名稱Multiphoton Laser Scanning Microscopy。在生物及醫學成像,單分子探測,三維信息存儲,微加工等領域得到廣泛套用,展示了廣闊的發展前景
在雷射照射下 ,基態螢光分子或原子吸收一個光子後成為激發態 ,隨後又弛豫到某一基態 ,同時以光子形式釋放能量而發出螢光. 這一過程就是通常的單光子激發情況。
多光子激發歷程
1931，Maria G?eppert-Mayer，理論預言1970年代，多光子光譜學
1989 ，Denk, Stricklerand Webb (Cornell University, USA)，多光子顯微鏡
1996，Bio-Rad，商業產品
多光子激發特點
激發波長：兩個或多個光子同時激發,激發波長是單光子激發波長的兩倍或多倍(i.e. 紅光能激發UV探針)多光子激發：依賴於多個光子同時到達的時間：使用脈衝飛秒雷射器(i.e. 10-16seconds),且能提供更高的峰值功率；螢光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產生多光子吸收。
螢光強度正比於(雷射強度)n
優勢
1、利用紅光或紅外光激發，光散射小(小粒子的散射與波長的四次方的成反比）
2、不需要針孔，能更多收集來自成像截面的散射光子。
3、針孔不能區分由離焦區域或焦點區發射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好
4、單光子激發所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對深層激發。
5、在生物顯微鏡觀察方面,最先考慮的是不損壞生物本身的活性狀態,維持水分、離子濃度、氧和養分的流通。在光觀察場合,無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細胞不受損傷的照射量、光能量內。
6、多光子顯微鏡則能夠滿足此,而且還具有很多優點。如三維解析度、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往雷射顯微鏡不具備,或具有無法比擬的超越特性。
多光子共焦雷射掃描顯微鏡已延伸到各個研究和套用領域. 它能對處在自然狀態下的樣品進行三維無損觀察 ,並能提高系統的解析度和信噪比.利用多光子激發後材料性質的變化 ,還可以實現三維高度數據存儲和三維任意方向的微細加工 ,具有很高的套用價值. 可以相信 ,隨著與多光子共焦顯微鏡相關的機械、材料、雷射技術等的進一步發展 多光子共焦雷射掃描顯微鏡將得到更大的發展和更廣泛的套用.
套用實例
活體動物和腦片神經細胞結構與功能活體動物腦皮層毛細血管網的成像
胚胎髮育過程的長時間動態觀測
多光子激發光解籠與光激活
細胞內微區鈣動力學
多光子激發自發螢光
其它套用：螢光漂白恢復(FRAP)
螢光共振能量轉移（FRET）
螢光相關譜(FCS)
單分子探測
光動力治療
不足
1、只能對螢光成像。2、如果樣品包括能夠吸收激發光的色團,如色素,樣品可能受到熱損傷。
3、解析度略有降低,雖然可以通過同時利用共焦的小孔得到改善,但是信號會有損耗。
4、受昂貴的超快雷射器限制, 多光子掃描顯微鏡的成本較高。
