目標獲取
從基因文庫中獲取
①基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。
②基因文庫的種類：1、基因組文庫；2、部分基因文庫。
利用PCR技術擴增目的基因
①PCR含義：是一項在生物體外複製特定DNA片段的核糖合成技術。全稱是多聚酶鏈式反應。
②PCR原理：DNA雙鏈複製。
③前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。
④擴增過程：目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，如此重複循環多次。
⑤結果：每次循環後的目的基因的量增加一倍，即成指數形式擴增。
人工合成
如果基因較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。
技術比較
| DNA 複製 | PCR 技術 | 基因克隆 | |
| 場所 | 細胞核 | 生物體外 | 細胞內 |
| 酶 | 解鏇酶、 DNA 聚合酶 | Taq 酶 | 限制酶、連線酶 |
| 載體 | 不需要 | 不需要 | 需要 |
| 遵循原則 | 鹼基互補配對 | 鹼基互補配對 | 鹼基互補配對 |
| 結果 | DNA 分子 | DNA 分子片段 | DNA 分子片段 |
載體構建
組成
1、 目的基因；2、 啟動子；3、 終止子；4、 標記基因。
功能
1、使目的基因在受體細胞中穩定存在，並且可以遺傳給下一代；2、使目的基因能夠表達和發揮作用。
步驟
⑴、用一定的限制酶切割質粒，使之出現一個黏性末端切口。
⑵、用同種限制酶切割目的基因，產生相同的黏性末端。
⑶、將目的基因片段插入質粒切口，加入適量DNA連線酶，使目的基因與質粒形成重組質粒。
⑷、基因表達載體的構成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因
目標導入
轉化
目的基因進入受體細胞內，並且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
受體種類
⑴、微生物：細菌細胞
⑵、植物細胞：卵細胞、受精卵、體細胞
⑶、動物細胞：受精卵、胚胎細胞
導入方法
⑴、微生物：感受態細胞法
①、感受態細胞：指細菌細胞經過Ca2+處理後，細胞壁透性增強，能夠吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。
②、過程：CaCl2+處理細胞 → 感受態細胞 → 表達載體與感受態細胞混合 → 感受態細胞吸收DNA分子。
⑵、植物細胞： 農桿菌轉化法、 基因槍法、 花粉管通道法
①、農桿菌：土壤微生物，易感染雙子葉植物和裸子植物；對大多數單子葉植物沒有感染力。
②、Ti質粒的T_DNA可轉移到受體細胞，並整合到受體細胞染色體DNA上。
③、過程：目的基因插入T_DNA，T_DNA進入農桿菌，將農桿菌導入植物細胞。
⑶、動物細胞： 顯微注射法
①、目的基因表達載體經過提純備用，取得受體動物的卵（或受精卵）備用。
②、採用顯微注射技術將目的基因表達載體注射到卵（或受精卵）中。
③、培養液培養成為早期胚胎。
④、將早期胚胎移植到雌性動物子宮內，發育成新個體。
檢測鑑定
⑴、檢測：
①、導入檢測：檢測受體細胞染色體DNA上是否含有目的基因。
DNA分子雜交法（DNA探針法）。
②、表達檢測：檢測目的基因是否完成轉錄出mRNA。
分子雜交法檢測RNA。
檢測目的基因是否完成表達翻譯成蛋白質。
提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原——抗體雜交。
⑵、鑑定：個體生物學水平鑑定，鑑定抗性等。
