基因工程的基本操作程式

基因工程的基本操作程式指的是生物基因工程技術中的一種操作的程式。

目標獲取

從基因文庫中獲取

①基因文庫:將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。

②基因文庫的種類:1、基因組文庫;2、部分基因文庫。

利用PCR技術擴增目的基因

①PCR含義:是一項在生物體外複製特定DNA片段的核糖合成技術。全稱是多聚酶鏈式反應。

②PCR原理:DNA雙鏈複製。

③前提條件:有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據這一序列合成引物。

④擴增過程:目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈,引物與單鏈相應互補序列結合,在DNA聚合酶的作用下進行延伸,如此重複循環多次。

⑤結果:每次循環後的目的基因的量增加一倍,即成指數形式擴增。

人工合成

如果基因較小,核苷酸序列又已知,可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。

技術比較

DNA 複製 PCR 技術 基因克隆
場所 細胞核 生物體外 細胞內
解鏇酶、 DNA 聚合酶 Taq 限制酶、連線酶
載體 不需要 不需要 需要
遵循原則 鹼基互補配對 鹼基互補配對 鹼基互補配對
結果 DNA 分子 DNA 分子片段 DNA 分子片段

載體構建

組成

1、 目的基因;2、 啟動子;3、 終止子;4、 標記基因。

功能

1、使目的基因在受體細胞中穩定存在,並且可以遺傳給下一代;2、使目的基因能夠表達和發揮作用。

步驟

⑴、用一定的限制酶切割質粒,使之出現一個黏性末端切口。

⑵、用同種限制酶切割目的基因,產生相同的黏性末端。

⑶、將目的基因片段插入質粒切口,加入適量DNA連線酶,使目的基因與質粒形成重組質粒。

⑷、基因表達載體的構成:目的基因+啟動子+終止子+標記基因

目標導入

轉化

目的基因進入受體細胞內,並且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。

受體種類

⑴、微生物:細菌細胞

⑵、植物細胞:卵細胞、受精卵、體細胞

⑶、動物細胞:受精卵、胚胎細胞

導入方法

⑴、微生物:感受態細胞法

①、感受態細胞:指細菌細胞經過Ca2+處理後,細胞壁透性增強,能夠吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。

②、過程:CaCl2+處理細胞 → 感受態細胞 → 表達載體與感受態細胞混合 → 感受態細胞吸收DNA分子。

⑵、植物細胞: 農桿菌轉化法、 基因槍法、 花粉管通道法

①、農桿菌:土壤微生物,易感染雙子葉植物和裸子植物;對大多數單子葉植物沒有感染力。

②、Ti質粒的T_DNA可轉移到受體細胞,並整合到受體細胞染色體DNA上。

③、過程:目的基因插入T_DNA,T_DNA進入農桿菌,將農桿菌導入植物細胞。

⑶、動物細胞: 顯微注射法

①、目的基因表達載體經過提純備用,取得受體動物的卵(或受精卵)備用。

②、採用顯微注射技術將目的基因表達載體注射到卵(或受精卵)中。

③、培養液培養成為早期胚胎。

④、將早期胚胎移植到雌性動物子宮內,發育成新個體。

檢測鑑定

⑴、檢測:

①、導入檢測:檢測受體細胞染色體DNA上是否含有目的基因。

DNA分子雜交法(DNA探針法)。

②、表達檢測:檢測目的基因是否完成轉錄出mRNA。

分子雜交法檢測RNA。

檢測目的基因是否完成表達翻譯成蛋白質。

提取蛋白質,用相應的抗體進行抗原——抗體雜交。

⑵、鑑定:個體生物學水平鑑定,鑑定抗性等。

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