化學發光免疫分析原理
化學發光免疫分析包含兩個部分, 即免疫反應系統和化學發光分析系統。化學發光分析系統是
利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個激發態的中間體, 當這種激發態中間體
回到穩定的基態時, 同時發射出光子(hM) , 利用發光信號測量儀器測量光量子產額。免疫反應系統是將
發光物質(在反應劑激發下生成激發態中間體) 直接標記在抗原(化學發光免疫分析) 或抗體(免疫化學
發光分析) 上, 或酶作用於發光底物。
化學發光免疫分析的類型
化學發光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種:
(1)化學發游標記免疫分析法;
(2)酶標記、以化學發光底物作信號試劑的化學發光酶免疫分析法
化學發游標記免疫分析又稱化學發光免疫分析(CL IA ) , 是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用於標記的化學發光物質有吖啶酯類化合物——acridin ium ester (A E) , 是有效的發游標記物[ 3 ] , 其通過起動發光試劑(N aOH2H2O 2 ) 作用而發光, 強烈的直接發光在一秒鐘內完成, 為快速的閃爍發光。吖啶酯作為標記物用於免疫分析, 其化學反應簡單、快速、無須催化劑; 檢測小分子抗原採用競爭法, 大分子抗原則採用夾心法 , 非特異性結合少, 本底低; 與大分子的結合不會減小所產生的光量, 從而增加靈敏度。
化學發光酶免疫分析從標記免疫分析角度, 化學發光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,
CL E IA ) , 應屬酶免疫分析, 只是酶反應的底物是發光劑, 操作步驟與酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體) 進行免疫反應, 免疫反應複合物上的酶再作用於發光底物, 在信號試劑作用下發光, 用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP) 和鹼性磷酸酶(AL P) , 它們有各自的發光底物。
常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲醯肼,lum ino l) , 或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲醯肼) , 是一類重要的發光試劑。魯米諾的氧化反應在鹼性緩衝液中進行, 在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH·) , 過氧化氫(H2O 2) ]存在下,生成激發態中間體, 當其回到基態時發光, 其波長為425nm。
早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體) , 但標記後發光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體, 進行免疫反應後利用魯米諾作為發光底物, 在過氧化物酶和起動發光試劑(N aOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發光, 發光強度依賴於酶免疫反應物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM 半自動分析系統就是利用這一體系專門設計的。
(enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )
在發光系統中加入增強發光劑, 如對2碘苯酚等, 以增強發光信號, 並在較長時間內保持穩定, 便於重複測量, 從而提高分析靈敏度和準確性。在全自動分析儀上, 還可通過計算機嚴密控制, 進行自動操作, 如加試劑, 混合, 溫育, 洗滌, 加發光試劑, 發光計數, 數據處理, 繪製標準曲線, 直至完成病人血清樣品的分析並列印出結果。Am erliteTM 發光增強酶免分析系統用螢光素、噻唑等增強劑, 其發光時間可持續長達20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測的
促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。
所用底物為環1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發光底物 , 用於化學發光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩定作用的基團——金剛烷基, 其分子中發光基團為芳香基團和酶作用的基團, 在酶及起動發光試劑作用下引起化學發光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3’2 PHO spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2’2 螺金剛烷) 242甲氧基242(3’2 磷醯氧基) 2苯基21, 22環二氧乙烷)。在鹼性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基發生水解而脫去一個磷酸基, 得到一個中等穩定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) , 此中間體經分子內電子轉移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處於激發態的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當其回到基態時產生470nm 的光, 可持續幾十分鐘(如圖5)。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學發光底物, 可用來檢測鹼性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結合物。可檢測到鹼性磷酸酯酶的濃度為10- 15mo l?L 。
美國DPC 公司的Imm u lite 全自動酶放大發光免疫分析儀, 以鹼性磷酸酶為標記物, 以金剛烷作發光底物, 測定靈敏度相當於10- 21mo l?mL 的酶, 採用聚苯乙烯珠作載體, 其檢測水平已能達到10- 12g?mL。
其他發光免疫分析技術
3. 1 微粒體發光免疫分析(m icropart icle lum ines2cence enzym e imm unoassay,MLEIA )
3. 2 電化學發光免疫分析(elect rochem ilum inesc2ence imm unoassay, ECLIA )
3. 3 時間分辨螢光免疫分析( t im e2reso lved f luo2rescen t imm unoassay, TrFIA )
3. 4 雷射免疫分析( laser imm unoassay,LIA )
