基本原理
硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜具有很強的靜電吸附力，在中性條件下即可有效地吸附蛋白質等生物大分子。因而，將抗原吸附於纖維素膜後，就可利用纖維素膜作為固相進行抗原抗體反應。當加入抗體後(即可與膜上的抗原結合，犎;後再加入帶有標記物的抗體，使標記通過抗抗體和相應抗體的結合間接地交聯於纖維素膜上。加入標記物相應的底物後，標記物即可與底物作用形成不溶性產物,呈現斑點狀著色,從而判定結果。根據所用的標記物不同，可分為：辣根過氧化物酶免疫斑點試驗（使用辣根過氧化物酶作為抗抗體的標記物)，鹼性磷酸酶免疫斑點試驗(使用鹼性磷酸酶抗鹼性磷酸酶複合物作為酶標記物)和金銀染色免疫斑點試驗(使用膠體金作為抗抗體的標記物)等。其中，最常用的是以辣根過氧化物酶標記系統為基礎的免疫斑點試驗。下面以辣根過氧化物酶免疫斑點試驗和鹼性磷酸酶免疫斑點試驗為例作一簡單介紹。
基本步驟
方法一 辣根過氧化物酶免疫斑點試驗
將0.01M PBS PH7.4 稀釋的抗原液2μl
點於硝酸纖維素膜(或醋酸纖維素膜)上
↓
置37℃溫箱中乾燥20～30分鐘
↓
滴加封閉液37℃溫盒中封閉10分鐘
↓
用洗滌液洗1～2次，濾紙吸乾
↓
加用稀釋液稀釋的抗體或待檢標本，置
37℃濕盒中30分鐘
↓
用洗滌液震洗3次×3分鐘、吸乾
↓
水洗終止反應，觀察結果。出現明顯綜
色斑點者為陽性
方法二 鹼性磷酸酶免疫斑點試驗
將0.01M PBS PH7.4 稀釋的抗原液2μl
點於硝酸纖維素膜上
↓
置37℃溫箱中乾燥20～30分鐘
↓
用封閉液37℃濕盒中封閉10分鐘
↓
用洗滌液震洗1～2次，濾紙吸乾
↓
加稀釋液稀釋的小鼠抗體或待檢標本，
置室溫濕盒中30分鐘
↓
用洗滌液震洗3次×3分鐘，吸乾
↓
加1∶50稀釋的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，
置室溫濕盒中30分鐘、洗同前、吸乾
↓
加APAAP複合物於膜上、室溫濕盒中30分
鍾，洗同前、吸乾
↓
加1∶50稀釋的抗鼠IgG血清，置室溫濕
盒中10分鐘，震洗1次、吸乾
↓
加APAAP複合物，溫育、洗滌同“9”
↓
重複“9”和“10”1～3次
↓
洗滌液震洗3次×3分鐘、吸乾
↓
滴加新配底物溶液顯色5～10分鐘，水洗中
止反應，觀察結果
主要材料與試劑
1. 硝酸纖維素膜(N、C)：浙江黃岩人民化工廠出品。
2. 洗滌液：含0.5%Tween20的0.01M PBS PH7.4
0.2M Na2HPO4 87ml ┐
0.2M Na2HPO4 13ml │
NaCl 15.2g │─-→加H2O至2000ml
Tween 20 6ml ┘
3. 封閉液(抗體稀釋液)：
1M D-glucose 19.817g
2ml 甘油(2%)
加含0.35% T20的0.01M PBS至100ml
4. 辣根過氧化物酶底物溶液
DAB 5mg ┐用前取1ml
0.05M PH7.6 Tris-HCl 10ml┘
加3%H2O2 0.01ml
5. 鹼性磷酸酶抗鹼性磷酸酶複合物(APAAP複合物)
6. 鹼性磷酸酶底物溶液
影響因素
1. 包被N、C膜的抗原濃度對試驗結果影響較大。多以蛋白質含量500～1000μg/ml為宜。濃度過高可出現假陽性，過低則降低試驗的敏感性。
2. 酶結合物濃度對試驗成功與否至關重要。最適濃度常與包被抗原濃度有關，應根據試驗具體條件作方陣滴定來確定。
3. 顯色時間，一般認為5-10分鐘較好。顯色時間過長常導致本底著色加深，降低試驗的特異性。
4. 用抗原包被NC檢測抗體時，待檢樣品加樣不宜過多。加樣過多可使相鄰的樣品混淆，一般5～10μl即可。
