生平
天正十四年，在島津家迫降失去英主龍造寺隆信的龍造寺家後，一方面由肥後北上蠶食大友領地，另一方面則讓四弟島津家久統率大軍從日嚮往豐後攻打，同時島津義久大量驅使謀略以所領安堵的條件大規模地對大友家旗下諸將進行內應工作。眼見大友家大勢已去的入田義實首先與島津義久內通，之後南山城主志賀鑒隆、久住町的麻生紹和、朝日岳城守將柴田紹安相繼傳出成為島津軍內應的訊息。除此之外，松牟禮城主田北鎮利、 鳥屋城一萬田鎮實、山野城的朽網鑒康、鎮則不但在面對島津軍時直接降伏更進一步將島津家的勢力引入築後一帶。
在四周的友軍一個接一個倒向島津方後，島津家久勸降的使者也來到了梅牟禮城。佐伯惟定不但堅拒了使者的勸降，還將使者當場斬殺，本來兩軍交鋒，不斬來使，佐伯惟定這番無禮的舉動正是要表明自己誓死對抗的決心和意志。在擊退了來襲的島津軍之後，佐伯惟定與甫突破新納忠元包圍的岡城城主志賀親次一同展開熾烈的反擊，將當初被島津家寢返的南郡諸城逐步奪回大友家，使大友家得到更多的喘息空間，支持到豐臣秀吉出陣。天正十五年正月，豐臣秀吉正式開始進行九州討伐，期間大為活躍的佐伯惟定在得到秀吉所賜的感狀後隨秀長軍反攻，再立戰功。
相關事件
文祿元年，豐臣秀吉發起朝鮮侵略，佐伯惟定做為大友軍的一員從軍參陣，不料主公大友義統翌年在朝鮮戰場上得知敵方大軍來襲的訊息後，居然立刻自前線逃跑，引起秀吉大怒，因此遭到改易處份，佐伯惟定因是大友家臣而亦遭到牽連不得不離開佐伯氏已經居住了四百年的故鄉下野，後來羽柴秀保賞識惟定昔日武勛將他推薦給筆頭家老藤堂高虎擔任其麾下的侍大將 ，在高虎入國伊予宇和島得到七萬石的封地時佐伯惟定也從高虎處拜領了兩千石的俸祿，再次投入朝鮮戰場，佐伯惟定已成為藤堂軍的其中之一。
在秀吉死後，於慶長五年石田三成與德川家康展開決定天下誰屬的關原會戰，主君藤堂高虎因為素與家康修好而投入東軍，是役之中佐伯惟定並未參戰而是被任命伊予板島城留守居役的職務，戰後藤堂高虎被轉封至伊勢津城，此後十年間身為藤堂藩士之一的佐伯惟定主要負責領內的各城的普請職務。
關原之戰後，德川家康開創江戶幕府，身任征夷大將軍，隨後又把將軍之位讓於世子秀忠，稱大御所。但是他心中仍然有一塊陰影，就是居於大阪城中的豐臣秀賴，於是他費盡苦心方硬借方廣寺鐘銘的事件挑起大阪之戰。在夏之陣中佐伯惟定與藤堂高吉一同擔任先鋒在八尾合戰中與長宗我部盛親交戰，率先以鐵炮攻擊射殺了盛親的先鋒大將吉田內匠，但是在盛親熟稔的指揮下，長宗我部軍於長瀨川堤防上布陣反擊，反倒痛擊藤堂軍，令高虎失去藤堂高刑、藤堂氏勝、桑名一孝等武將，佐伯惟定和藤堂高吉在攻破盛親的先鋒軍火速回援方緩住盛親的猛攻，直到井伊直孝來援才逼退長宗我部軍，但藤堂高虎軍同樣是損失慘重，折損了部將六人、隊長七十一人、三百餘名兵士戰死，元氣大傷。
由於前日和長宗我部盛親的交戰中藤堂軍受到重創，因此辭退了翌日在天王寺的最終決戰里先鋒之職，但佐伯惟定和藤堂高吉還是擔任藤堂軍的先鋒，戰後因功增加五百石，總共領有四千五百石的知行領位列藤堂藩的重臣之一。
其它
元和四年，佐伯惟定逝世，享年五十歲，法名宗忠功月大禪定門。
