2001年10月,國際人類蛋白質組組織(Human Proteome Organization, HUPO)在美國成立,並計畫啟動人類蛋白質組計畫
(HumanProteome Project, HPP). HPP的研究目的是鑑定人類基因組編碼的全部蛋白質及其功能,揭示:
a.構成各種人類組織不同細胞類型的蛋白質表達譜;
b.蛋白質組翻譯後修飾譜;
c.蛋白質組亞細胞定位圖;
d.蛋白質一蛋白質相互作用關係圖;
e.蛋白質結構與功能聯繫圖等.
包括對不同發育階段,不同生理和病理狀態下蛋白質的空間與時間上表達狀況的認識.HPP是繼人類基因組計畫後又一個
國際化的重大科學研究項目,其首批執行計畫包括:人血漿蛋白質組計畫(Human Plasma ProteomeProject, HUPO PPP)
和人肝臟蛋白質組計畫(Human Liver Proteome Project,HLPP )由於技術手段和數據處理上的複雜性和多樣性,使得蛋
白質組研究比基因組研究困難和複雜得多.作為人類蛋白質組研究的"探路者",HUPOPPP的先期(pilot phase)目標是:
比較不同樣本收集,處理和儲存過程對蛋白質分析的影響;通過分析血漿蛋白質組，比較不同蛋白質組分析技術平台的
敏感性和局限性;比較不同高豐度蛋白去除(depletion)方法,以及去除與否的差異;數據提取,整理和儲存的標準化等,
全面認識人類正常血漿/血清中的全部表達蛋白及其在不同生理條件下的變異度。
HUPO PPP由美國科學家Gilbert Omenn牽頭,目前有來自世界十多個國家和地區的57個實驗室參加.該計畫啟動階段
要求所有參加實驗室均使用相同的"參考樣品"(reference specimens),該參考樣本分別由英國,美國和中國按照同一標準提
供,製備成不同人群的混合血漿(EDTA,肝素和構椽酸鈉抗凝血)和血清.代表世界上主要人種的參考樣本取自部分志願者,
他們分別屬於白種美國人(Caucasian-American ),非洲裔美國人(African-American),亞裔美國人(Asian-American)和
亞裔中國人(Asian-Chinese).在此基礎上,使用各實驗室不同的技術平台,不同的蛋白質組學實驗方案,全面鑑定和分析
正常人血漿/血清蛋白質組.選擇血漿作為人類蛋白質組研究的"探路者"主要基於以下考慮:
a.血漿蛋白質組是最複雜的人類蛋白質組,其中包含著不同組織的亞蛋白質組;
b.血漿蛋白取材方便,能夠獲得足夠的研究樣本,容易標準化;
c.血漿蛋白的性質具有很大的動態範圍;
d.血漿/血清是臨床檢查最主要的樣本來源,對疾病診斷和療效監測具有重要的意義;
e.多數血漿蛋白的表達水平與其相應mRNA的水平相關性很差,且普遍存在糖基化,磷酸化等翻譯後修飾現象,只能從蛋白
質水平上開展研究。
1.血漿蛋白的定義和分類
血漿蛋白的組成十分複雜,以往把那些在血漿中出現,並在血漿中發揮作用的蛋白質稱為血漿蛋白.隨著蛋白質組學
研究的發展,目前把血漿中的所有蛋白質統稱為血漿蛋白.根據其來源和功能可分為:
a.組成性蛋白,主要指肝臟和小腸的分泌蛋白,它們在血漿中發揮作用,如白蛋白,纖維蛋白原等;
b.免疫球蛋白,血漿中大約含有數百萬種抗體;
c."長距離"受體和配體,如胰島素等生長因子;
d."局部"受體和配體,如IL-8等蛋白質因子;
e.一過性通過蛋白,如溶酶體蛋白酶;
f.組織滲漏蛋白,如心肌球蛋白;
g.異常分泌蛋白,如PSA等腫瘤相關蛋白；
h.外來蛋白,如病毒蛋白等.其中,前兩類是血漿蛋白的主要組成成分,屬於高豐度,大分子質量和易於檢測的蛋白質.目前
被分離,鑑定並用於臨床診斷的血漿蛋白多屬於此類.
後幾類血漿蛋白多為低豐度蛋白,它們種類繁多,性質各異,作用重要,分離和鑑定相當困難.比如,通常在細胞內發揮作用,
但當細胞死亡或損傷後被釋放到血漿中的組織滲漏蛋白,腫瘤或其他病變器官釋放到血漿中的異常分泌蛋白等,它們對認
識疾病演變過程,分離疾病特徵標誌和藥物靶標具有重要意義。
2.人類已知的血漿蛋白
目前還不知道血漿蛋白的確切種類和數量.保守地估計組成性血漿蛋白約有500種,它們多為糖蛋白,平均每種蛋白質
至少具有5種不同的結構,如前體分子(precusors ),成熟形式(matureforms ),降解產物(degradation products),;(及
不同的剪接體(splice variants)等,預計由5萬種不同的蛋白質分子組成;另一部分是組織滲漏蛋白,可能包括全部人類
蛋白質組.如果按5萬種基因產物計算,平均每種產生10種不同的結構,就會有50萬種蛋白質分子;血漿中出現序列不同免
疫球蛋白的可能性有近千萬種,但是它們不會同時在血漿中全部出現.Pieper, Tirumalai和Adkins等採用不同的技術策
略,分別從血漿中鑑定出325,341和490種不同的蛋白質.Anderson等總結了截至2004年初所鑑定的血漿蛋白為1175種。
由於血漿蛋白組成複雜,蛋白質組學研究技術各有利弊,靠單一技術平台不能達到最佳分離效果.聯合使用不同技術
平台(主要包括:去除高豐度蛋白,樣本預分離系統,分離系統,質譜鑑定系統),並加以適當改進是目前通常的做法幾種主
要的研究策略如下：
a高豐度蛋白去除+色譜分離+2-DE+聯合質譜鑑定:Pieper等採集兩名健康男性志願者血清,首先用免疫親和吸附法去除
血清8種主要的高豐度蛋白;然後經色譜預分離(pre-fractionation),包括離子交換色譜(anion-exchange chromatog-
raphy,AEC)和分子篩色譜(size-exclusion chromatography,SEC);將富集的低豐度蛋白組分(fractions)經二維電泳
(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)分離,得到近3 700個蛋白質點;這些蛋白質首先經MALDI-TOF質譜鑑定,
再將未能鑑定的蛋白質點進一步用LC-MS/MS串聯質譜分析.最終,獲得了325個完整的蛋白質.
b.鳥槍測序法(Shotgun sequencing),即高豐度蛋白去除+全蛋白酶解+二維液相色譜(陽離子/陰離子交換色譜+反相色
譜)分離+質譜鑑定(離子阱或Q-TOF串聯質譜):Adkins等採集女性志願者血清,首先用protein A/G吸附去除免疫球蛋白,
胰蛋白酶對血漿全蛋白酶解;酶解後經強陽離子交換(strong cation exchange, SCX)和反相(reversed phase)色譜分
離後,進一步經電噴霧液相離子阱質譜(LCQ Ion Trap)鑑定,獲得490種不同血漿蛋白,並把蛋白質鑑定效率提高了3一5
倍；
c.血漿全蛋白預分離(色譜聚集+反相高壓液相色譜)+組分胰蛋白酶酶解+串聯質譜鑑定(LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+
MALDI-TOF-TOF-MS ) c Beckman公司於2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血漿蛋白預分離系統.血漿蛋白
先經多維色譜分離,各分離組分經胰蛋白酶酶解後直接進行質譜鑑定.克服了2-DE的缺點,簡化了信息處理上的複雜性.
d.多重窄pH範圍2-DE+聯合質譜鑑定(MALDI-TOF+LC-MS/MS):Starita-Geribaldi等通過使用相差1個pH範圍的多重固相
pH梯度乾膠條,大大提高了傳統2-DE的分離效率,經MALDI-TOF + LC-MS/MS聯合質譜分析後使蛋白質鑑定的效率增長兩
倍,並且改善了極酸和極鹼性蛋白質的分離和鑑定效果.
e.非變性等電聚焦預分離+變性等電聚焦預分離+1D分離+質譜鑑定(LC/MS/MS ) ;Giometti等通過實驗證明在非變性條
件下(不破壞蛋白質的三級結構)進行二維電泳,分離到的蛋白質仍然保持原始狀態,使蛋白質生物功能和蛋白質之間相
互作用的檢測成為可能,克服了傳統2-DE的缺陷(採用變性條件).Manabe等通過採用非變性二維電泳與變性二維電泳相
結合的方法,成功地從人血漿中分離,鑑定出多個IgG結合蛋白,這一方法將成為研究蛋白質功能的一個有效手段.
f.SELDI-TOF分離+Q-TOF質譜鑑定:表面增強雷射解吸/離子化一飛行時間質譜(surfaceenhanced laser desorption/
ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一種以固相表面親和為基礎的質譜分離技術.完整血漿蛋白先經過與不同親
和表面(化學表面晶片和生物表面晶片)結合純化後,再經過SELDI質譜分離.由於結合蛋白是未經剪下的,很多蛋白質的質
荷比非常接近,因此該技術無法鑑定所分離的蛋白質,需要進一步結合Q-TOF質譜鑑定。由於該技術能夠相對簡單,快速地
鑑別出不同分析樣本的差異蛋白質,尤其是小分子蛋白,因此在血漿蛋白的分離和鑑定中與上述其他技術具有很大的互補
性,已被用於疾病相關的血漿蛋白質組研究中.Petricoin等用疏水型晶片結合併分離了卵巢癌患者血漿相關蛋白,在腫瘤
和健康血清之間發現了5個差異明顯的蛋白質峰,它們共同構成卵巢癌診斷模型,用該模型對腫瘤和健康人血漿進行盲篩,
該模型診斷腫瘤的敏感性為100%,特異性為95 %. Li等選用金屬離子鰲合晶片結合併分離乳腺癌血漿蛋白,發現3個乳腺
癌特異的差異蛋白峰.用這3個特異蛋白標誌盲篩一組乳腺癌和健康人血漿蛋白,乳腺癌檢出的敏感性為93%,特異性為91%.
Adam等利用同樣的技術策略找到了9個區別前列腺癌和良性前列腺增生與健康志願者血漿的差異蛋白峰,其敏感性為83%,
特異性為97%.此外,SELDI-TOF技術也在結腸癌,肺癌,食管癌,肝癌等其他惡性腫瘤生物標誌物的研究方面取得了較好的結果。
人類蛋白質組組織（HUPO）於2001年宣告成立。它積極倡導並推進了“人類蛋白質組計畫”（HPP），旨在從細胞、組織和器官整體水平發現和確認人類蛋白質組組織的種類、數量、存在方式、相互作用、修飾狀態及亞細胞定位等。這一
計畫得到眾多國家的積極回響。2002年11月，在法國凡爾賽首屆HUPO大會上，宣布先行啟動“人類血漿蛋白質組計畫”（hppp）和“人類肝臟蛋白質組計畫”（HLPP）兩項重大國際合作計畫，標誌著“人類蛋白質組計畫”正式啟動。
由美國科學家吉爾伯特·歐曼牽頭的“人類血漿蛋白質組計畫”（HPPP），是生命科學領域第一個人體體液的蛋白質組計畫，目前有13個國家的47個實驗室參加。其科學目標是全面分析人類血漿和血清蛋白成分，確定不同人種血漿蛋白質的差異程度，通過生物標記方法，確定不同時期和不同條件下的個體差異（包括生理如年齡、性別、經期、勞動作業和病理狀態如特定疾病以及一般藥物治療）的改變，我國也派出科學家參與這一合作計畫。
展望雖然蛋白質組技術有了長足的進步和新的,高通量和自動化的分離,鑑定技術平台相繼出現,但人類蛋白質組研究尚處在"探路"階段,其複雜性也許超乎人們的想像.蛋白質組研究中的許多技術"瓶頸"問題還沒有解決.血漿蛋白質組研究將會成為新的研究熱點,完全解析血漿蛋白質組,闡明每個蛋白質的功能,描繪出蛋白質間相互作用的網路,需要全世界科學家繼續努力,任重而道
遠.對血漿蛋白質組的深入研究,將為無數疾病患者帶來診治的希望,成為醫學發展史上的又一個里程碑.
