werstern bloting

⑹NC膜的封閉:將NC膜放入一塑膠袋中,加入封閉液3ml,封口,輕輕震盪2h。 ⑻洗膜:棄去反應液,用一抗稀釋液洗三次,每次10min。 ⑾將膜放入顯色液中,室溫輕輕搖動,10min。

Western bloting技術是用來檢測蛋白表達的特定的靈敏的方法,由蛋白質的SDS-PAGE、電轉及雜交幾部分組成。雜交技術主要有NC膜封閉,靶蛋白與第一抗體的反應,結合靶蛋白的一抗和二抗的反應,顯色等組成。將凝膠上的蛋白質轉移到NC膜上,用其他蛋白作為封閉液,將膜上餘下的其他蛋白結合位點封閉,加入與檢測蛋白特異性的第一抗體,經免疫反應,一抗與靶蛋白結合,經洗膜液洗滌後,膜上僅在靶蛋白上結合抗體。在加入與第一抗體有免疫特異性的二抗,使之與一抗反應,反應後,經洗膜液洗滌,二抗僅存在於結合靶蛋白的一抗上。因為這種二抗都為酶標抗體,通過酶標反應,在顯色液中,膜上結合靶蛋白—一抗—二抗的位置即將呈現一定的顏色。
二、材料與方法
1.材料
從微生物細胞中提取的多酚氧化酶(PPO):10μl,20μl
NC膜:硝酸纖維素膜
2.儀器:
電轉移槽,電泳儀,塑膠封口機,搖床
3.試劑:
轉移緩衝液:48Mm Tris,39mM甘氨酸,0.037%SDS同時加入20%乙醇。
封閉液與稀釋液:PBS(牛血清白蛋白)
辣根過氧化物酶顯色液:現配現用
三、操作步驟
1.SDS-PAGE電泳見上個實驗
2.電轉
⑴剪NC膜大小、濾紙與凝膠板一致,浸泡在轉移緩衝液中5min。
⑵在轉移裝置中依次將三層濾紙、凝膠、濾紙、三層濾紙放在一起。
⑶將裝好的轉移裝置放入電轉移槽中NC膜一側向正極,凝膠一面向負極。
⑷接通電源電壓63V,電流90mA,轉移過夜。
⑸轉移結束後,取出裝置,依次取掉各層,用鉛筆在膜的上沿做標記,切下其中一個孔所對應膜的一半。
⑹NC膜的封閉:將NC膜放入一塑膠袋中,加入封閉液3ml,封口,輕輕震盪2h。
⑺將封閉好的NC膜放入另一塑膠袋中,加入用封閉液稀釋的一抗,2.8ml,封口。4℃下輕搖2h。
⑻洗膜:棄去反應液,用一抗稀釋液洗三次,每次10min。
將膜從PBS中取出轉至150mM氯化鈉,50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中輕輕震盪10min。
⑼將二抗用二抗稀釋液稀釋,將NC膜放入塑膠袋中,加入二抗溶液2.8ml。封口,輕輕震盪1h。
⑽洗膜:取出膜轉至150mM氯化鈉,50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中輕輕震盪10min,三次。
⑾將膜放入顯色液中,室溫輕輕搖動,10min。
⑿待條帶出現後,立刻用水洗膜,然後轉入PBS中,觀察記錄。

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