名稱
binding-changeATP
結合變構機制
簡介
氧化磷酸化偶聯位點
根據對呼吸鏈中不同複合物間氧化還原電位的研究，發現複合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ每傳遞一對電子，釋放的自由能都足夠合成一分子ATP，因此將複合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ看成是呼吸鏈中電子傳遞與氧化磷酸化偶聯的三個位點。
如果以FADH2作為電子供體，則只有兩個ATP合成偶聯位點。因為FADH2提供的電子是經複合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ傳遞的，而複合物Ⅱ不能作為ATP合成的偶聯位點，所以只有兩個偶聯位點，這就意味著由FADH2作為電子供體時，只能合成兩分子的ATP.
實驗證明
上述ATP合成的數量和偶聯位點得到實驗的支持。如將分離的線粒體內膜小泡與抗黴素（antimycin）一起溫育，由於抗黴素阻止電子通過細胞色素b-c1（複合物Ⅲ），NADH釋放的電子只能傳遞到輔酶Q，其結果，每傳遞一對電子只合成一分子ATP.因此可以推論複合物Ⅰ是ATP合成的偶聯位點。用同樣的方法證明複合物Ⅲ和複合物Ⅳ也都是ATP合成與電子傳遞偶聯位點。
偶聯因子1（couplingfactor1）的發現及功能預測
發現：在二十世紀七十年代初，Humberto-FernandezMoran用負染技術檢查分離的線粒體時發現：線粒體內膜的基質一側的表面附著一層球形顆粒，球形顆粒通過柄與內膜相連（圖7-30）。幾年後，EfraimRacker分離到內膜上的顆粒，稱為偶聯因子1，簡稱F1.
圖7-30ATP偶聯因子電鏡照片
牛心臟線粒體的負染電鏡照片，可見球形顆粒通過小柄附著線上粒體內膜嵴上。
功能預測
如果按照常規的方式思考所發現顆粒的問題，似難理解線粒體內膜上需要ATP水解酶，如果將ATP的水解看成是ATP合成的相反過程，F1球形顆粒的功能就顯而易見了：它含有ATP合成的功能位點，即ATPase既能催化ATP的水解，又能催化ATP的合成，到底行使何種功能，視反應條件而定。
實驗證明
通過體外實驗證明上述的推測是正確的，現在將該酶稱為ATP合酶。
請設計一個實驗證明ATPase既能催化ATP的水解，又能催化ATP的合成
線粒體ATP合酶的發現和功能預測及實驗證實表明，在科學研究中，不能總是按常規思維去認識事物，反向理論也有很重要的作用。
ATP合酶功能的鑑定：線粒體膜重建實驗
為了證明F1具有ATP合酶的作用，人們試圖進行線粒體膜的重建實驗，主要是將線粒體內膜與其嵴上的F1顆粒分離出來，重新裝配後研究F1的功能。
實驗的結果確證從線粒體內膜中分離的F1顆粒具有偶聯電子傳遞和ATP合成的功能。
ATP合酶（ATPsynthase）的結構和功能
電鏡下的結構
從電鏡照片（圖7-31）看，線粒體內膜內側的F1顆粒結構可分為兩個基本部分：F1（頭部，headsection）、F0（基部，basesection），在F1和F0之間有一個細細的柄部（stalksection）。
圖7-31ATP合酶的形態
（a）電鏡照片；（b）根據電鏡照片繪製的模式圖和各部分的大小。
組成
F1顆粒是一個多組分的結構，將它稱為F0F1ATP酶複合物，或ATP合酶，在分離狀態下具有ATP水解酶的活性，在結合狀態下具有ATP合成酶的活性。除了線粒體中有ATP合酶外，植物葉綠體的類囊體和好氧細菌都有ATP合酶的同源物，線粒體ATP合酶有F0和F1兩部分組成（圖7-32），主要功能是進行ATP的合成。也有學者將它看成是線粒體內膜呼吸鏈的第五個複合物（complexⅤ）。
圖7-32ATP合酶的結構和組成
氧化磷酸化偶在線上理：化學滲透假說
關於氧化磷酸化的偶在線上理，先後提出過幾種假說，如化學偶聯假說（chemicalcouplinghypothesis）和構象偶聯假說（conformationalcouplinghypothesis），這些假說由於證據不足得不到公認。
英國生物化學家P.Mitchell於1961年提出了化學滲透偶聯假說（chemiosmoticcouplinghypothesis）解釋氧化磷酸化的偶在線上理。該學說認為：在電子傳遞過程中，伴隨著質子從線粒體內膜的裡層向外層轉移，形成跨膜的氫離子梯度，這種勢能驅動了氧化磷酸化反應（提供了動力），合成了ATP.這一學說具有大量的實驗支持，得到公認並獲得了1978年諾貝爾獎。化學滲透學說可以很好地說明線粒體內膜中電子傳遞、質子電化學梯度建立、ADP磷酸化的關係（圖7-33）。
圖7-33線粒體在有氧呼吸中的主要作用
ATP合酶合成ATP的機理
結合變構模型（binding-changemodel）
ATP合酶合成ATP的分子機理的研究一直是研究的熱點，為多數人接受的ATP合酶合成ATP的模型是“結合變構模型”。該模型認為F1中的γ亞基作為C亞基旋轉中心中固定的轉動桿，旋轉時會引起αβ複合物構型的改變。有三種不同的構型，對ATP和ADP具有不同的結合能力：①O型幾乎不與ATP、ADP和Pi結合；②L型同ADP和Pi的結合較強；③T型與ADP和Pi的結合很緊，並能自動形成ATP，並能與ATP牢牢結合。當γ亞基旋轉並將αβ複合物轉變成O型則會釋放ATP（圖7-34）。
圖7-34結合變構模型
定子（stator）和轉子（rotor）
Timothy等人提出了一個ATP合酶中能量轉化過程的模型（圖7-35），該模型認為由abα3β3δ組成了“定子（stator）”，cγε則形成“轉子（rotor）”。當H+質子穿過a和c之間的通道時產生了力矩，從而推動了轉子與定子間的相對轉動，這樣在F1中合成了ATP.
圖7-35F0F1-ATP合酶作用機理圖解
γ亞基旋轉的離體培養證明
目前已經可以在光學顯微鏡下觀察到F1中γ亞基的旋轉運動（圖7-36），但現在還沒有直接的證據顯示在F0中有某些亞基作旋轉運動。
圖7-36F1和γ旋轉的實驗證明
實驗中對F1進行人工改造，使之帶上組氨酸（每個亞基一個），由於組氨酸能夠同覆蓋有金屬還原劑（Ni）的玻片結合，因此可使F1固定到這種玻片上。通過人工的方法將γ結合上一條螢光標記的肌動蛋白纖維，然後在供給ATP的情況下用螢光顯微鏡觀察γ亞基的轉動
TheNobelPrizeinChemistry1997
| PaulD.Boyerand JohnE.WalkerhaveshownhowtheenzymeATPsynthasemakesATP.ATPsynthaseisfoundinchloroplastandmitochondrialmembranesandinthecytoplasmicmembraneofbacteria.AdifferenceinhydrogenionconcentrationacrossthemembranedrivestheenzymetosynthesiseATP. "TheBindingChangeMechanism" UsingchemicalmethodsPaulBoyerproposedthatATPsynthaseislikeacylinderwithalternatingalphaandbetasubunits.Anasymmetricalgammasubunitinthemiddleofthecylindercauseschangesinthestructureofthebetasubunitswhenitrotates(100r.p.s.).Hetermedthesestructuresopen(betaO),loose(betaL)andtight(betaT). FourstagesinATPsynthesis | ||
| Amolecularmachineisdiscovered JohnWalkercrystallisedtheenzymetostudyitsdetails.HeestablishedthatBoyer'sproposalforhowATPsynthesistakesplace,the"molecularmachine",wascorrect. | ||
| ATPsynthase TheenzymeconsistsofanFOpartboundinthemembraneandaprojectingF1part.TheF1partisknownindetail,whilelessisknownabouttheFOpart. TheFOpartconsistsofthreedifferentproteinmolecules(subunitsa,bandc).Whenhydrogenionsflowthroughthemembraneviaadiscofcsubunits,thedisciscompelledtorotate.ThegammasubunitintheF1partisfixedtothediscandthereforerotateswithit.ThealphaandbetasubunitsintheF1part,however,cannotrotatebecausetheyarelockedinafixedpositionbythebsubunit,whichisanchoredtosubunitainthemembrane. Asthegammasubunitfunctionsasanassymmetricalaxle,thebetasubunitsarecompelledtoundergothestructuralchangesdescribedinthefigures |
