研發背景
美國PacficBio公司開發研製的革命性的第三代PacbioRSDNA測序系統提供了單分子水平上對生物分子的實時分子。成功解決了二代測序幾大困擾:海量數據拼接,變異檢測假陽性高,高GC含量區域無法跨越,高度重複偏殿無法準確測定等,得到高質量,完整的數據信息。特點
使用該PacBioRS測序系統,完成一個人的基因組測序的測試時間,將由目前(2009年)的6周縮短為10—15分鐘;與第二代測序儀在原理和效能上有本質區別,通過對單分子的操作而減少繁雜的生物學反應,同時結合對海量數據的高效率處理技術,形成對基因序列的快速、低成本解讀。測序原理
PacBioRS測序系統原理是用一種聚合酶將DNA的複製限制在一個微小的間隙中,給各種鹼基加上螢光示蹤標記,當鹼基合成DNA鏈時,這些螢光標記就會發出不同顏色的閃光,根據閃光顏色就可識別出不同的鹼基。測序流程
1. 文庫製備材料:全基因組DNA,或者cDNA,或者目標擴增產物
片段化:全基因組太大需要片段化,因為測序讀長很長,可以做很大的片段文庫(3-10kb)
連線:先把片段粘末端變成平端,兩端分別連線環狀單鏈:單鏈兩端分別與雙鏈正負鏈連線上,得到一個類似啞鈴(“套馬環”)的結構,稱為SMRTBell。連線半小時內完成。
2. 引物退火+聚合酶結合
當引物與模板的單鏈環部位退火後,這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。
3. 測序策略
萬事俱備,一旦向反應中加入正常的離子,DNA聚合反應開始了。模板雙鏈打開成環形,先合成正鏈,單鏈區,跟著合成負鏈。聚合酶每合成一圈,對於定向目標序列,就相當於2x覆蓋度。由於合成產物和天然產物一致,聚合酶可以持續合成很長很長的產物,亦即循環合成很多圈(重複多次),對於定向單分子目標序列來說就可以得到很高的覆蓋度,即獲得很多subread,這就意味著可以對非常低的頻率的片段獲得很高的準確度,這稱為環形一致序列(circleconsensus)模式,該模式適用於稀有突變及需要高精確度的測序。這也是單分子測序能比NGS靈敏度更高地,高準確度地檢測到稀有突變的原理。
TBC服務內容
(一)細菌基因組測序完成圖(二)DNA甲基化檢測