發現
2007年日本學者Soda等在1例吸菸的肺腺癌患者腫瘤組織中發現了ALK基因和EML4融合而成的具有致瘤性的變異基因。EML4和ALK兩個基因分別位於人類2號染色體的p21和p23帶，相隔約10Mb距離。這兩個基因片段的倒位融合能夠使得組織表達新 的融合蛋白EML4-ALK。通過體外克隆性轉化實驗和體內基因重組基礎上的肺部選擇性表達實驗證實：不同的EML4-ALK融合突變體均具有惡性轉化和致瘤性能力。根據這些證據可以將融合基因定義為肺癌的一種新的癌基因。
發生率及因素
京都大學的研究結果發現111例女性患者中4例有EML4-ALK融合基因，202例男性患者中僅有1例。另有研究發現，所有EMLA-ALK融合基因患者均為女性且少吸菸或不吸菸者。
美國麻省總醫院研究結論認為，在經選擇的患者中13%具有EML4-ALK融合基因，22%具有EGFR基因突變，65%兩者均為野生 型。與EGFR基因突變和兩種基因均為野生型的患者相比，EML4-ALK融合基因在較年輕患者中和男性患者中更多。EML4-ALK 融合基因患者與兩種基因均為野生型患者相比，不吸菸或少吸菸者更少。94.7%的EML4-ALK融合基因存在於肺腺癌患者中 ，且此類融合基因患者接受EGFR-TKI治療後效果不明顯。
總的說來，EML4-ALK融合基因主要存在於不吸菸或少吸菸的肺腺癌患者中，而且通常與EGFR基因不同時存在於同一患者。這些基因特徵為進一步的ALK抑制劑的臨床研究提供了有用信息。
研發最新進展
2010年，ASCO大會上來自韓國的Bang等報導了輝瑞公司PF02341066（crizotinib）化合物Ⅰ期臨床試驗的結果：82例 EML4-ALK融合基因陽性患者入組，其中96%（79/82）是肺腺癌。50例可評價療效患者的客觀有效率達57%，8周時疾病控制 率87%，6個月時無進展生存率達到72%，主要不良反應是胃腸道反應，包括噁心、腹瀉和嘔吐，但均為輕微的不良反應，患者完全可耐受，3～4度不良反應僅見於實驗室指標如丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶的升高。由於有如此的有效率和安全性，美國FDA批准crizotinib直接進入Ⅲ期臨床試驗，目前基於EML4-ALK融合基因陽性的肺癌二線或三線的全球臨床試驗正在進行中，中國也參與其中。
Crizotinib被媒體稱為“這是一個在合適的患者使用合適藥物的典型代表”。然而，和已經套用於臨床的激酶抑制劑（如伊馬替尼和EGFR抑制劑）一樣，ALK抑制劑crizotinib的套用也可引起靶激酶本身的繼發耐藥突變。Choi等報導了1例對初 始crizotinib治療高度應答而後復發的患者，其EML4-ALK激酶結構域內出現了兩種繼發突變（C1156Y和L1196M），這些新的突變導致了腫瘤細胞對多種ALK抑制劑.耐藥。Ariad Pharmaceuticals公司正在開發另一種小分子化合物AP26113，這種 藥物有望成為crizotinib產生耐藥性後的二線藥物。現在還沒有發布ALK的晶體結構，所以Ariad Pharmaceuticals公司應 用了一種標準的同源建模方法來設計抑制劑。實驗室和動物實驗顯示，ALK多個突變被確定授予抗PF1066，而對AP26113無 抗藥性。這些ALK的突變體進行了三個在小鼠腫瘤模型測試，在每種情況下，AP26113可有效阻止腫瘤的生長，而PF1066是 無效的。此外，AP26113展現出對ALK陽性細胞大約為PF106610倍的選擇性，並表現出優異的性能，包括每日1次口服給藥的潛力。該公司計畫在今年開始這個藥物的Ⅰ期臨床試驗。
此外，“等最近對另一個強有力的和有選擇性的ALK小分子抑制劑TAE684進行了研究。研究發現TAE684抑制EML4-ALK的活化及其包括ERK、AKT和STAT3在內的下游信號。他們用基因晶片分析開展H2228治療非小細胞肺癌移植瘤模型後TAE684基因 表達的變化有針對性的途徑研究，並確定了EML4-ALK的抑制基因簽名。該基因簽名代表1210種已知的人類基因，這些基因 代表的生物過程包括細胞周期、DNA合成、細胞增殖和細胞凋亡。他們還比較了PF2341066、an-Met和TAE684目前在臨床中 的試驗效果，並證明TAE684是EML4-ALK的更強有力的抑制劑。
融合基因篩檢
隨著藥物研發的順利進展，一個重要的問題需要關注，即在臨床患者中採用何種技術手段選擇基因融合變異的患者呢？最早發展檢測肺癌中ALK基因融合的技術是DNA水平的FISH及mRNA水平的RT-PCR。由於ALK基因在正常肺組織中表達水平極低 ，而一旦與EML4發生融合後則ALK蛋白表達水平顯著上調，故ALK融合的肺癌組織也可以用免疫組織化學方法來檢測ALK的表達水平而反映融合狀態。
在非小細胞肺癌的病例中，多種EMLA-ALK融合基因的突變體己經被發現，多數是由於EML4基因的斷裂點不同導致，因此精確診斷EML4-ALK陽性腫瘤需要檢測EML4基因和ALK基因cDNA的所有融合方式，現已發現並確認至少9種EML4-ALK融合基因的 突變體：v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7。Takeuchi等在目前已知EML4-ALK融合轉錄突變體的基礎上，採用三 條引物組成的多重RT-PCR技術檢測目前已知的多種突變體。且由於EML4-ALK為倒位融合，野生型組織細胞採用該RT-PCR不 會產生擴增條帶。該方法基於PCR技術，敏感且特異性好，粗略明確EMLA-ALK融合突變體。但也存在一些不足，對於潛在的非EML4基因與EML4-ALK融合則不能被檢測到，而且對於潛在的EML的第21個外顯子與ALK融合的轉錄突變體長度達1284bp ，可能難於檢測到。
Mino-Kenudson等採用CST（Cell Signaling Technology）公司的新型抗體來檢測肺癌樣本的ALK融合蛋白表達並用FISH技 術來驗證。結果提示CST公司的免單克隆抗人CD246抗體（D5F3或D9E4克隆，Danvers，USA）均能檢測到ALK融合陽性的肺 癌樣本表達EML4-ALK融合蛋白，明顯優於小鼠來源的單克隆抗體（ALK1克隆，Dako USA）。單克隆抗體結合免疫組織化學 方法檢測ALK的表達狀態具有簡便快速的優點，對於肺癌的組織細胞學等樣本具有篩選價值，但也需要同時考慮到免疫組 織化學方法總是存在一定的主觀性，對弱陽性結果的判讀需要進一步用FISH等技術來驗證。
廣東省肺癌研究所吳一龍教授課題組Zhang等採用RACE-PCR測序的新技術檢測分析ALK的融合變異。該方法的獨到之處在於 採用含有反轉錄的RACE結合兩輪PCR技術來富集擴增ALK的融合變體，敏感度高。該方法不僅檢測EML4與ALK的融合.同樣可 以檢測到其他任何基因與ALK的融合，且進一步通過測序的手段能夠明確融合是來自EMLA-ALK多種突變體中的具體哪一種。這對臨床的指導意義可能更大。已知不同EMIA-ALK融合突變體的酪氨酸激酶活性程度有明顯差異，因而可能對臨床用藥 劑量具有一定的指導價值。這個問題有待於在臨床試驗中進一步分析驗證。
總結
EML4-ALK融合基因作為具有獨特臨床特徵的肺癌的又一分子標誌物，昭示著針對ALK的靶向治療將促使肺癌個體化治療更加精準有效和逐步走向成熟完善。然而，對EMI4-ALK融合基因的檢測方法還有待於改善，以提高其檢出的特異性和敏感性。假以時日，對於EML4-ALK融合基因抑制藥物的研發與改進，定將取得突破性進展。
