簡介
酶聯免疫標記技術是繼螢光標記技術、放射性核素標記技術之後發展起來的一項靈敏、特異、快速且可實現自動化的新技術，由於具有安全、穩定、容易觀察等優點，近幾年來發展十分迅速。此實驗是根據抗原或抗體結合到固相載體表面後，能保持其免疫活性，而抗原或抗體與酶結合後也能保持免疫學和酶的活性。酶結合物與相應抗原或抗體形成複合物，在底物的催化下發生顯色反應，可根據加入酶底物溶液的顯色深淺反應，判定有無相應的免疫反應及抗原或抗體的量。
自20 世紀70年代問世以來，就因其高度的準確性、特異性、適用範圍寬、檢測速度快以及費用低等優點，成為檢驗中廣泛套用的方法之一， 其中套用最多的是酶聯免疫吸附法(ELISA) 。由於ELISA 的技術條件要求低，攜帶方便，操作簡便和經濟，常以試劑盒的形式出現且易商品化，它已成為一種套用最為廣泛和發展最為成熟的生物檢測與分析技術。
ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記，根據酶反應底物顯色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，間接放大了免疫反應的結果，使測定具有極高的靈敏度，在套用中一般採用商品化的試劑盒進行測定。完整的ELISA 試劑盒包含7個組分，分別是：包被了抗原或抗體的固相載體、酶標記的抗原或抗體、酶的底物、陰性和陽性對照品、參考標準品和控制血清、結合物及標本的稀釋液、洗滌液、酶反應終止液。
ELISA 在食品安全檢測中的套用
近年來，ELISA 技術在食品安全檢測中正逐步得以推廣套用，如對天然毒素、農藥殘留、獸藥殘留、致病微生物、轉基因成分和激素等的檢測 。
毒素檢測
真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物,其中的十幾種對人危害較大, 它們一般都具有毒性強和污染高的特點, 而毒性最大、致癌性最強的是黃麴黴毒素(AFL) 。自1977 年黃麴黴毒素B1的單克隆抗體問世至今,幾乎所有重要的真菌毒素( 如赭麴黴毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青黴毒素、伏馬毒素等) 的ELISA 檢測方法均已建立。在對黃麴黴素B1 的檢測中, 其檢測的線性範圍為0.25～5.0 ng/mL, 靈敏度為12.5 pg, 整個檢測過程為4 h。
農藥殘留檢測
套用ELISA 檢測食品中的殘留農藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。1993 年, 王勇等建立了測定三唑酮的ELISA 方法, 套用於黃瓜、梨等食品的檢測,其最低檢出限為40 ng/g, 回收率為92.44% ～98.18% , 與用氣相色譜檢測的結果吻合。1995 年, 余萬俊等用抗殺蟲脒單克隆抗體為試劑, 建立了間接競爭法、直接競爭法和標記抗原競爭法3 種檢測大米中殺蟲脒的ELISA, 使用直接競爭法的檢出限為0.05 ng/g, 相對標準偏差為5.1% ～16% 。2000 年Watanabe E 等用合成的烯菌靈半抗原偶聯蛋白質形成大分子免疫原進行免疫生產單克隆抗體, 建立了測定柑橘類水果中烯菌靈的ELISA 法。對日本檸檬、柑橘和葡萄柚中烯菌靈的檢測限為5 μg/g。2000 年Katsoudas E等建立了新鮮食品中氨基甲酸酯類殺蟲劑殘留的ELISA 法。在香蕉、番茄、桃等果蔬中檢測胺甲萘以及蟲蟎威的檢測限分別為2.0 μg/g 和8.0 μg/g。儘管ELISA 的檢測限度還不能完全達到經濟已開發國家技術法規和限量標準的要求,而且存在抗體製備不易和不能同時完成多種農藥殘留檢測等缺點, 但是由於該技術具有樣品前處理簡單、分析時間短、適合做成試劑盒用於現場篩選等優點, 使其可在蔬菜產區、蔬菜批發市場配備, 隨時把農藥殘留超標的蔬菜、水果杜絕在食用之前, 因此特別適用於我國分散生產、分散銷售的現狀。
獸藥殘留檢測
目前大部分ELISA 主要用於動物組織及其代謝物中獸藥殘留及飼料中違禁藥物的測定, 其檢測限和靈敏度都達到相當高的程度。其中檢測磺胺類、氯黴素類、苯並咪唑類、同化激素類、苯乙胺(β- 受體激動劑) 類藥物一般採用抗體包被直接競爭法。該法主要用於飼料、牛奶、血漿、豬肝臟、牛肝臟和豬尿中上述藥物的測定。如對國家嚴禁使用的鹽酸克倫特羅( 瘦肉精) 的測定, 血清中最低檢測濃度為0.5 ng/mL, 動物組織中最低檢測濃度為0.5 μg/kg, 飼料中最低檢測濃度為5 μg/kg。另外, 沈美芳等用ELISA 法檢測水產品中氯黴素殘留, 氯黴素濃度在0.05～4.05 μg/kg, 最低檢測限為90 ng/kg。結果表明該方法靈敏度高、重複性好, 適合水產品中氯黴素殘留篩選檢測。檢測氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類藥物一般採用抗原包被直接競爭法, 該法主要用於牛奶、血漿、尿液及腎臟組織中卡那黴素、慶大黴素、新黴素等藥物的測定, 最低檢測濃度達0.3 ng/mL。檢測β- 內醯胺類、喹諾酮類、阿維菌素類、聚醚類和多肽類藥物一般採用抗原包被間接競爭法, 該法主要用於飼料、雞肝臟、雞肉、牛奶、血清、牛肝臟中桿菌肽鋅、鹽黴素、莫能菌素、伊維菌素及青黴素的測定。如雞肝臟組織中鹽黴素的最低檢測濃度為1～10 ng/mL, 飼料中桿菌肽鋅的最低檢測濃度為1.0 mg/kg, 血清、牛乳中恩諾沙星的最低檢測濃度為1～10ng/mL。
細菌污染檢測
ELISA 法可檢測沙門氏菌、軍團菌、大腸桿菌等病原微生物, 其中沙門氏菌是最常見的致病菌。用ELISA 試劑盒較傳統檢測法更能方便、快速地檢測沙門氏菌。用ELISA 法檢測沙門氏菌採用的抗體既可以是單克隆抗體(McAb) , 也可以是多克隆抗體。另外, Lyer MS 和CousinMA 等人研究用間接ELISA 法來檢測食品和飼料中鐮刀菌的靈敏度和特異性, 可檢測出102～103 cuf/mL 的含量。
轉基因食品檢測
目前對轉基因食品檢測主要採用兩種方法: (1) PCR 法用於直接檢測轉基因; ( 2) ELISA法用於間接檢測轉基因表達的目的蛋白質。美國FDA 已研究出用雙夾心ELISA 法檢測食品中是否含有轉基因玉米成分。EnviroLogix ELISA 試劑盒可用於測定玉米中的Cry9C蛋白, 在同一實驗室和實驗室間共測定了9 種含玉米的食品, 測定結果的重現性很好。Lipp 等使用ELISA 法, 通過抗體特異性地與CP4- EPSPS ( 5- 烯醇丙酮醯莽草酸- 3-磷酸合酶, 來源於農桿菌CP4) 蛋白結合, 檢測RRS( Rundup Ready Soybean, 抗草甘膦大豆) 。13 個EU 成員國和瑞典共37 個實驗室研究結果表明, 大豆乾粉中轉基因組織(GMO) 含量為2%, 檢測可信度達99%。
影響ELISA 的因素
ELISA 是利用抗體的選擇性和標記酶的化學放大靈敏性而建立起來的, 因此, 影響ELISA 測定結果的因素主要包括:
1. 抗原包被: 包被的質量是影響抗原- 抗體反應的重要因素。目前蛋白質類抗原的包被技術已經相當成熟, 但是對半抗原, 通常採用以半抗原- 載體結合物的形式包被。蛋白質( 如牛血清白蛋白、卵白蛋白) 是最常見的載體,但存在重現性不好、易和抗體發生交叉反應的缺陷。Verschoor 報導用尼龍作為半抗原載體, 效果會更好。
2. 非特異性反應: ELISA 中可以發生許多非特異性反應, 嚴重干擾分析結果, 選擇適當抗體組合可以明顯地減少這類反應的發生。通常採用一些簡單的前處理, 如在包被液中加入牛血清白蛋白或明膠等封閉劑, 在洗滌液中加入Tween 20 等。高選擇性的單克隆抗體代替多克隆抗體也是提高ELISA 特異性的另一個有效途徑。
3. 酶和抗體的偶聯: 酶和抗體偶聯的好壞直接影響試劑的靈敏度。套用於ELISA 的酶主要有辣根過氧化氫酶(HRP) 和鹼性磷酸酯酶(AKP) , 其中以HRP 用得最多。目前HRP 與抗體的偶聯多採用改良的高碘酸鈉氧化法( 改良Wilson's 法) , AKP 與抗體偶聯通常採用戊二醛法和偶氮法。
4. 酶的底物: 當酶標記抗體- 抗原複合物和酶的底物相遇時, 複合物中的酶水解底物, 使無色的底物溶液生成有色的反應產物, 根據顏色的深淺測出待測物。因此酶底物的選擇對準確和迅速地顯示結果影響很大。HRP 如果採用H2O2- 鄰苯二胺或H2O2- 鄰聯甲苯胺作為底物, 由於反應產生的顏色深淺與H2O2 的用量有關, 因此在底物溶液的配製時應注意控制好H2O2 的用量。但目前更多的採用3', 5'- 四甲基聯苯胺( TMB) , 因為其毒性小又穩定。
5. 洗滌: ELISA 法中每次反應後都要洗滌, 這既保證了反應的定量關係, 也除去了血清中與反應無關的其他成分及游離的酶複合物。洗滌效果與檢測結果密切相關, 因此, 最好做到洗滌步驟按標準化操作 。
ELISA 技術的發展趨勢
基因工程和蛋白質工程的發展, 為生物酶標分析技術提供了新的技術思路和方法,彌補了其缺陷和技術局限, 使其具有更為廣泛的檢測範圍、更高靈敏度與特異性和更精確的定量能力, 從而使ELISA技術以新的形式套用於食品檢測領域。系列化、標準化、商品化和多功能化的新型ELISA 試劑盒產品不斷被開發出來。該技術未來的發展將呈以下趨勢 :
1. 高度免疫原性的重組抗原: 通過基因工程技術可以快速、批量生產出具有高度免疫原性的重組抗原, 用來替代某些無法從天然材料中分離的抗原物質, 進一步擴大了ELISA 檢測範圍。重組抗原在純度上要高於通過裂解病原體所提取的抗原。用於檢測的重組抗原有可能最終達到以下兩個標準: ( 1) 包括所有能引起機體強免疫應答的病原體抗原決定簇; ( 2) 不含或儘可能少含非特異性抗原或共同抗原。
2. 多項目標物快速測定: 利用酶聯免疫技術同時對待測樣本中的多項目標物進行快速測定, 可節省測定時間。可通過以下兩種方法來達到這一目的: ( 1) 通過基因工程技術表達特定的融合蛋白質將多種不同蛋白質的功能構建在一起, 可以快速方便地同時檢測多項目標物; ( 2) 採用幾種能夠催化各自底物產生不同顯色反應的酶分別標記具有不同特異性的抗體或抗原, 反應後用各自的酶底物顯色, 從而達到同時檢測多項目標物。
3. 天然酶定向改造和體外分子進化: 運用天然酶定向改造和體外分子進化手段, 研究開發的免疫測定標記酶融合蛋白( 一種同時具有催化底物顯色反應酶活性和特異性抗體或抗原性質的融合蛋白) 可以作為結合物直接用於ELISA 試劑盒。這使得ELISA 試劑盒在其生產過程中不但避免了繁瑣且低效率的酶與特異性抗體或抗原的化學交聯過程, 而且無需得到純化的酶和抗體或抗原, 從而大大提高了ELISA 試劑盒產品的穩定性, 使其結果具有更好的重現性。
4. 自動化的酶聯免疫測定技術: 近幾年出現的全自動酶標測定儀, 不但大大減輕了檢測人員的工作強度, 而且也提高了測定的準確性和重現性, 這更有利於ELISA 技術在檢測分析中的進一步商品化推廣 。
