表皮幹細胞的概念、位置及數量
幹細胞具有終身、無限的自我更新能力。它是一種具有產生至少一種以上高度分化子代細胞潛能的細胞。從發生機制來看年，幹細胞並不直接分化產生終末分化細胞，而是先分化成短暫擴充細胞（transit amplifying cells），短暫擴充細胞有產生定向分化成某種終末分化細胞的能力，因而是定向祖細胞（committed progenitors）。短暫擴充細胞再經過幾次到十幾次不等的分裂後定向分化，進一步可分化為有絲分裂後細胞（post-mitotic cells）及終末分化細胞（terminally-differentiated cells）。短暫擴充細胞的存在說明組織靠較少量的幹細胞分裂為很多的子代分化細胞［2］。幹細胞自我更新和分化的方式通常有兩種，一種是不對稱方式分裂，即1個幹細胞分裂成1個幹細胞和一個定向祖細胞，常見於單細胞生物和無脊椎動物；另一種是具有高度調控機制的分裂方式，幹細胞按一定的機率分裂成幹細胞或定向祖細胞，即幹細胞按一定的機率分裂為兩個幹細胞或兩個定向祖細胞，或按不對稱方式分裂,一般認為哺乳類動物即以此種方式進行自我組織更新。細胞的更新具有準確無誤性，幹細胞在整個增殖過程中處於相對靜止狀態，而由短暫擴充細胞完成DNA合成和細胞擴充的任務，幹細胞在分裂後仍保留其原有的遺傳信息，短暫擴充細胞擁有新複製DNA序列，以保證差錯僅停留在短暫擴充細胞水平。通常幹細胞等數分裂幹細胞和定向祖細胞，當受到損傷等情況時，幹細胞的分裂方式會發生改變以適應機體的需要［1，3］。
表皮幹細胞最顯著的兩個特徵是它的慢周期性（slow cycling）與自我更新能力。慢周期性在體內表現為標記滯留細胞（label-retaining cell），即在新生動物細胞分裂活躍時參入氚標的胸苷，由於幹細胞分裂緩慢，因而可長期探測到放射活性，如小鼠表皮幹細胞的標記滯留可長達2年。幹細胞的自我更新能力表現為在離體培養時細胞呈克隆性生長，如連續傳代培養，細胞可進行140次分裂，即能產生1×1040個子代細胞［1，4］。此外，表皮幹細胞還有一個顯著特點是對基底膜的黏附。幹細胞主要通過表達整合素（integrins）實現對基底膜各種成分的黏附。整合素是一種由1個α亞基、1個β亞基組成的的雙亞基蛋白，不同的α亞基與不同的β基組成了多種整合素，其中由β1亞基組成的整合素在表皮幹細胞與基底膜的黏附中起重要作用。各種整合素作為受體分子與基底膜各種成分相應的配體結合，如與層黏連蛋白結合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1及α6β4，與纖維黏連蛋白結合的有整合素α3β1，與膠原結合的有整合素α2β1。幹細胞對基底膜的黏附是幹細胞維持其特性的基本條件。幹細胞對基底膜的脫黏附是誘導幹細胞脫離幹細胞群落，進入分化周期的重要調控機制之一［5］。此外，目前體外分離、純化表皮幹細胞也是利用幹細胞對細胞外基質的黏附性來進行的［6］。
幹細胞通常處於靜息狀態，分裂緩慢，在形態學上表現為細胞體積小，胞內細胞器稀少，細胞內RNA含量低，在組織結構中位置相對固定。雖然各種實驗對表皮幹細胞的位置和數量報導不一，但一般認為毛囊隆突部（皮脂腺開口處與立毛肌毛囊附著處之間的毛囊外根鞘）含有豐富的幹細胞。幹細胞與短暫擴充細胞在表皮基底層呈片狀分布，在沒有毛髮的部位如手掌、腳掌，表皮幹細胞位於與真皮乳頭頂部相連的基底層，其它有毛髮的皮膚表皮幹細胞則位於表皮腳處的基底層。表皮基底層中有1%～10%的基底細胞為幹細胞，隨著年齡的增大，表皮腳與真皮乳頭逐漸平坦，表皮幹細胞的數量也隨之減少，這也是小兒的創傷癒合能力較成人強的重要原因之一［1，7］。
幹細胞分化的調控
幹細胞的分化行為是被預先程式化還是受周圍環境的調控一直是一個有爭論的話題，但幹細胞所處的微環境［又稱為幹細胞壁龕（niche）］對幹細胞分化調控的影響是存在的［8］。幹細胞的分化受細胞與細胞（包括間質細胞如成纖維細胞、肥大細胞等）、細胞與細胞外基質間相互作用的影響。細胞因子在傳遞細胞與胞外基質之間、細胞與細胞之間的信息中起重要作用，這些細胞因子包括白細胞介素（Ils）、幹細胞生長因子（CSF）、表皮細胞生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、肝細胞生長因子（hgf）等。細胞與細胞間相互調控信息還可通過細胞間黏著連線的β連環蛋白（β-catenin）來傳遞。此外，細胞外基質成分的改變也影響幹細胞的分化，整合素在其中起重要作用。當幹細胞微環境發生改變如損傷時，胞外某些信息可通過整合素α5β1、αvβ5及αvβ6傳遞給幹細胞，以觸發跨膜信號轉導，調控細胞的基因表達。這一過程不僅可以改變幹細胞的分裂方式，而且也激活幹細胞的多潛能性，使幹細胞產生一種或多種定向祖細胞，以適應組織修復的需要。因此，整合素α5β1、αvβ5及αvβ6也被稱為創傷癒合過程中的應急受體（emergency receptor）［4，8］。此外，表皮細胞在生長環境發生改變時可能會發生反分化。實驗發現，將在體已不表達整合素而表達角蛋白K10的有絲分裂後細胞分離進行體外培養，這類細胞又可表現出顯著的增殖能力，這與在創傷修復過程中已分化的基底層上部的表皮細胞可重新獲得增殖能力相似［5］。
表皮幹細胞脫離幹細胞群落進入分化階段的一個重要表現是通過c-myc誘導並伴隨表面整合素水平的下降，細胞對基底膜脫黏附，因而整合素水平的表達及幹細胞的黏附特性可能是維持幹細胞群落所必需的條件。整合素調控多種細胞的分化，其中表皮細胞與胞外基質黏附能力的缺失是終止幹細胞進行自我更新而進行終末分化的強刺激因素。將β1整合素缺失的小鼠胚胎幹細胞與表達野生型β1整合素的細胞相比，發現野生型幹細胞能分化出完整的表皮細胞譜系，而β1整合素缺失的幹細胞則不能產生分化的細胞。同樣，當細胞外基質不存在時也誘導幹細胞及短暫擴充細胞的分化，使表皮幹細胞退出幹細胞群落。此外還有實驗發現細胞外基質具有修飾β1整合素表達與激活的作用。因而各種損傷因素引起的細胞外基質變化都可對幹細胞的生物學行為產生作用。絲裂原激活蛋白酶(MAPK)在β1整合素調控表皮幹細胞增殖分化的信號轉導通路中起重要作用。將結構域陰性的β1整合素的突變體轉染到培養的人表皮形成細胞，以干擾其β1整合素的功能，降低β1整合素的黏附性，結果發現轉染成功的表皮幹細胞表面β1整合素水平及細胞與IV型膠原的黏附性明顯降低，MAPK活性減弱，細胞的克隆形成能力下降，增殖潛能喪失，表現出短暫擴充細胞的特徵。但通過超表達野生型β1整合素或激活MAPK則可上調整合素的表達，恢復其黏附性及增殖潛能［9］。
幹細胞的鑑別
利用幹細胞最顯著的兩個特徵即慢周期性及自我更新能力來鑑定在體與離體幹細胞是最基本且可靠的實驗手段。由於幹細胞的慢周期性，可採用標記滯留細胞的分析方法識別在體的靜息幹細胞。幹細胞的自我更新能力在體外培養則表現為無限的增殖能力，形成細胞克隆，從而識別離體的幹細胞。但這兩種方法套用不方便，目前利用表皮幹細胞一些相對特異的標誌建立了一系列的表皮幹細胞鑑別方法［1］。
由於表皮幹細胞及短暫擴充細胞表面高表達β1整合素，而有絲分裂後細胞及終末分化細胞不表達β1整合素，因而可以用β1整合素的抗體來鑑別表皮幹細胞及短暫擴充細胞。雖然表皮幹細胞β1整合素的表達量約為短暫擴充細胞的兩倍，但一般的光鏡下尚不能依靠β1整合素陽性強度的不同來區分幹細胞和短暫擴充細胞。如果利用雷射共聚焦顯微鏡，將組織切片進行1μm的斷層掃描，即在單層細胞水平上觀察，則可以分辯出幹細胞與短暫擴充細胞表達β1整合素陽性強度的差異［5，10］。
近來，有實驗結合幹細胞表面的α6整合素及另一個與增殖有關的表面標誌10G7，可以區分幹細胞與短暫分化細胞。檢測發現α6陽性而10G7陰性（α6bri10G7dim）的細胞處於靜息狀態，在體外培養中具有很強的增殖潛能，證實為幹細胞：而α6與10G7均陽性（α6bri10G7bri）的細胞是短暫擴充細胞，體外培養證實其增殖能力有限；α6陰性的細胞其角蛋白K10則呈陽性表達，說明是有絲分裂後終末分化細胞。因而可以利用α6整合素與10G7的單抗來區分幹細胞、短暫擴充細胞和分化的表皮細胞［10］。
角蛋白（Keratins）是表皮細胞的結構蛋白，它們構成直徑為10 nm的微絲，在細胞內形成廣泛的網狀結構。隨著分化程度的不同，表皮細胞表達不同的角蛋白，因而角蛋白也可作為幹細胞、定向祖細胞、分化細胞的鑑別手段。表皮幹細胞表達角蛋白19（Keratin19,k19），定向祖細胞表達角蛋白5和14（Keratin5、Keratin14,K5、K14），而分化的終末細胞則表達角蛋白1和10（Keratin1、Keratin 10，K1、K10）。實驗證實表皮基底層中K19與β1整合素表達均為陽性的細胞是標誌滯留細胞，具有幹細胞的慢周期性。一般認為毛囊的隆突部幹細胞及胎兒、新生兒表皮基底層幹細胞均表達K19，成人無毛髮皮膚如手掌、腳掌部位基底層的幹細胞K19表達陽性，但有毛髮皮膚基底層中的表皮幹細胞K19則表達為陰性［11，12］。又有實驗發現毛囊隆突部表皮幹細胞表達角蛋白15（Keratin15,K15），而且在幹細胞的分化過程中，K15表達的減少較K19表達的減少更早，K15陰性而K19陽性的細胞可能是“早期”短暫擴充細胞，故K15可能較K19在鑑別毛囊的隆突部表皮幹細胞更有意義［13］。
表皮幹細胞套用
大面積Ⅲ度燒傷、廣泛瘢痕切除、外傷性皮膚缺損以及皮膚潰瘍等導致的嚴重皮膚缺損，特別是大面積Ⅲ度燒傷傷及皮膚全層及其附屬檔案，因而僅靠創面自身難以實現皮膚的再生，需要足夠的皮膚替代物進行修復。臨床常用的修複方法有自體游離皮片移植、皮瓣移植術，異體皮/異種皮移植術和人工替代物覆蓋等方法。當大面積燒傷患者缺乏足夠的自體皮片或因異體/異種皮免疫排斥反應而需再度植皮時。可利用皮膚再生能力強的特點，進行自體皮的培養並套用於創面覆蓋。70年代中期體外培養表皮細胞就已經開始，培養的表皮細胞皮片是具有與在體表皮相似的生化、形態和功能特性的多層鱗狀上皮。套用於創面的表皮細胞皮片的培養是在表皮細胞傳遞系統上進行的，表皮細胞傳遞系統是種植、支持、轉運表皮細胞的三維支架，目前開發的表皮細胞傳遞系統有3T3細胞、聚烏拉坦、透明質酸、纖維蛋白膠與脫細胞真皮等。培養的皮片在體外及移植於創面後均保持有正常表皮的自我更新能力，即保留了幹細胞自我更新與分化潛能的特性。正常情況下，大部分的表皮幹細胞處於靜息狀態，只有部分幹細胞脫離幹細胞群落進入分化周期，維持皮膚的更新。由於體外培養條件下幹細胞分化成短暫擴充細胞、有絲分裂後細胞以及終末分化細胞的過程也同樣較為緩慢，因而目前用於自體移植皮片的培養周期最短也需兩周。因此，尚需改變培養條件以縮短培養時間。此外，由於培養皮片仍存在表皮全層較薄，皮片抗拉力差、抗感染力弱以及費用較為昂貴等缺點，因而影響了培養皮片的臨床使用［4，14］。
培養的表皮還用於異體移植，如套用於慢性潰瘍與II度燒傷創面。移植的異體表皮細胞在創面能合成與分泌多種生長因子和細胞因子，刺激創面周圍及底部殘存的表皮細胞增殖、分化、移行。人們還在嘗試將某些生長因子基因轉染入表皮細胞用於創面移植，使其在創面釋放足夠的生長因子，促進創面癒合［4］。由於培養的表皮細胞II型HLA-DR為陰性，也沒有起抗原提呈作用的Langerhans細胞，故不刺激宿主的免疫反應，因而可考慮作為深度創面如III度燒傷創面的永久覆蓋物。在大鼠實驗中，敲除培養表皮細胞的MHC，去除其免疫原性，可明顯延長在全層創面的存活時間［15］。
由於皮膚幹細胞終身存在，且幹細胞的遺傳信息可以傳給子代細胞，因而幹細胞不僅可以用來研究基因的作用以及某些疾病發病的基因機制，同時也可以用來對一些遺傳性皮膚病進行基因治療，包括導入標誌性基因或一個異源基因，使細胞內原有基因過度表達（增加功能），或基因打靶（失去功能）以及誘導某個基因的突變等。如通過敲除表皮幹細胞中的α6β4整合素基因，證實α6β4整合素不僅在穩定表皮細胞與基底膜的黏附中起重要作用，而且在基底細胞與胞外基質之間信號傳遞中起重要作用。此外，還發現一些遺傳性疾病的基因機制，如表皮細胞編碼整合素亞基α3、β3的基因突變，導致整合素表達異常，引起表皮與真皮的連線障礙，這是大皰性表皮鬆解症的重要病因之一［1，4］。
由於表皮的不斷更新，必須對細胞進行基因轉染以確保外源基因在表皮細胞的長期表達。為使外源基因在足夠多的幹細胞中表達，而不是在短暫擴充細胞中表達，需將表皮幹細胞與短暫擴充細胞分離開，這是實現基因治療的重要環節。儘管目前已成功將一些重組的基因引入表皮細胞，但大多數情況下，基因表達不超過4周，僅有少量報導能表達更長一些時間，而且表達的細胞不足基底細胞的1%，說明僅有很少的幹細胞成功轉染，因而要使幹細胞基因轉染成功，一種方法是使100%的基底細胞轉染成功，以保證其中少量幹細胞的成功轉染；另一種方法是體外分離幹細胞進行基因轉染。人們常用第一種方法，但這種方法轉染幹細胞很少，第二種方法也十分困難，因為區分幹細胞與短暫擴充細胞的方法尚未很好解決［1，16］。近來有文章報導能使轉染率提高，基因表達超過12周，主要是較好地解決了幹細胞的分離［17］。
在幹細胞的研究領域中，造血幹細胞的分化機制及臨床套用研究進行得較為深入與全面，最重要的原因之一是造血幹細胞及其分化的各系、各級子代細胞即造血幹細胞分化的“時”、“空”上均有特異的細胞表面標誌，容易進行細胞的鑑定與分離。而表皮幹細胞的研究尚不深入的主要原因是尚未找到能反應細胞分化、代謝狀況等精細變化特點的標誌物，且缺乏分離、純化表皮幹細胞的技術手段和調控增殖與定向分化的各種體外培養體系等。只能寄希望於新技術的發展來研究內在調控機制及細胞外微環境對表皮細胞系分化的影響。
1.一種分離純化皮膚表皮幹細胞的方法，其特徵在於，包括以下步驟：1)首先將已脫離人或動物的皮膚，置於含青鏈素各500U/ml的生理鹽水中帶回實驗室，在超淨工作檯上用生理鹽水沖洗，去血污及毛髮；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的虛，按上皮面朝上貼於直徑為60mm玻璃平皿中，每皿3～4塊，加培養基；所述培養基的配方為：90％Medium199+10％FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mLLIF+1～1.5μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素+100U/mL鏈黴素；3)置於CO2培養箱中培養，培養箱內的條件為5％CO2，飽和濕度，37℃；，每兩天換液一次；4)經3～4天后，從組織塊邊緣長出上皮樣細胞鋪路石樣生長，7～12天后，在上皮樣細胞層上有小圓形細胞聚集呈克隆樣生長，待這些克隆直徑達約100～150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin處理，用玻璃針將這些細胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑膠皿中，用無血清培養基培養；所述的無血清培養基的配方為：100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20ng/mL～25ng/mL)EGF+5ug/mLInsulin+(15ng/ml～20ng/mL)IGF-1+20ng/mLLIF+0.05μg/mL氫化可的松+100U/mL青黴素+100U/mL鏈黴素；5)待細胞增殖達70～80％融合時，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA進行消化，傳代培養，即用上述無血清培養基將關中奶山羊表皮幹細胞傳25代凍存，或用上述無血清培養基將人類表皮幹細胞傳15代凍存；6)對所獲得細胞進行當前同行公認的表皮幹細胞分子標誌的檢測：
