肉毒桿菌是一種生長在缺氧環境下的致病菌，全稱肉毒梭狀桿菌，在罐頭食品及密封醃漬食物中具有極強的生存能力，它在繁殖過程中所分泌的肉毒毒素具有極強的毒性，是KCN毒性的一萬倍。純化結晶的肉毒毒素1mg能殺死2億隻小鼠，對人的致死劑量約0.1μg。它通過阻斷人體神經接頭，導致全身麻痹、癱瘓，嚴重時能引起人呼吸肌麻痹，導致無法呼吸，最終死亡。目前報導紐西蘭恆天然濃縮乳清蛋白粉大批量被肉毒桿菌污染，多家產品被捲入其中，科標化工分析檢測中心為了我國奶粉質量安全，現開展食品中肉毒桿菌檢測。
科標化工分析檢測中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、SN等標準完成食品、微生物、飼料、藥品、紡織品、農業、高分子材料、生物產品、建築材料以及微生物產品理化性能、力學性能、電氣性能等測試。中心通過了中國國家認證認可監督管理委員會和中國合格評定國家認可委員會的二合一（CMA、CNAS）實驗室認證認可，能出具權威的第三方檢測報告。
食品中肉毒桿菌檢測(PCR檢測方法)
一、實驗原理
科標化工分析檢測中心結合國標GB/T4789.12-2003食品中衛生微生物學檢驗肉毒桿菌及內毒素檢驗和SN/T2525-2010食品中肉毒桿菌的PCR檢測方法對食品中肉毒桿菌進行檢驗。將樣品經增菌後劃平板分離單菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白腖葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY)培養基培養，對培養物用DNA提取試劑盒抽提DNA，進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物中是否含有肉毒桿菌的的特徵條帶，從而對食品中是否污染肉毒桿菌進行快速檢測。
二、儀器和試劑
HeraeusMultifugeX1R高速台式冷凍離心機，Bio-RADALS1296PCR儀器，Tanon-3500凝膠成像分析系統，YQX-Ⅱ厭氧培養箱，恆溫水浴鍋。三、試驗方法
1、樣品的增菌培養取庖肉培養基2管和TPGY培養基2管，煮沸10min~15min（為了排除溶解於培養基中的氧，切勿搖動），迅速冷卻。每15ml培養基中接種1g~2g固體食品或1ml~2ml液體食品（緩慢地將接種物接入肉湯液面下）。將樣品接種2管庖肉培養基（35±1℃下培養）和2管TPGY培養基（28±1℃下培養），均厭氧培養5天。觀察培養物的濁度、產氣、肉粒的消化和產生的氣味。若有生長繼續以下操作，若無生長，則繼續培養10天。
2、培養物分離
取2ml培養液置於無菌試管中，加入等量無菌無水乙醇，混勻，放置1h。用接種環取2環經處理過的培養物接種到厭氧卵黃瓊脂上，35±1℃下厭氧培養48h。挑取可疑菌落接種到TPGY培養基，35±1℃下厭氧培養24h。
3、DNA提取、擴增
取1.4mlTPGY培養物轉移到離心管中，13000r/min離心2min，棄去上清液。沉澱加入500µl生理鹽水，震盪重懸30s，13000r/min離心2min，棄去上清液。沉澱中直接加入50µlDNA提取液充分混勻，沸水浴10min，13000r/min離心3min，取上清液4µl進行PCR擴增。擴增的DNA跑瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果用凝膠成像系統記錄。
四、結果判定
陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽性對照出現預期大小的擴增條帶，待測樣品出現預期大小的擴增條帶則判定為PCR結果陽性，科標化工分析檢測中心報告“檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。待測樣品未出現預期大小的擴增條帶則判定為PCR結果為陰性，科標化工分析檢測中心報告“未檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。附圖
1、PCR擴增儀
PCR擴增儀 2、凝膠成像系統
凝膠成像系統3、厭氧培養箱
厭氧培養箱4、PCR擴增圖譜
PCR擴增圖譜肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗
1 主題內容與適用範圍
本標準規定了肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗方法。本標準適用於食品和食物中毒樣品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。
2 引用標準
GB4789.28 食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑3 設備和材料
3.1 離心機及離心管。3.2 研缽及細沙。
3.3 溫箱：30℃，35℃，37℃。
3.4 顯微鏡。
3.5 厭氧培養裝置：常溫催化除氧式或焦性沒石子酸除氧式。
3.6 吸管：1mL，10mL。
3.7 注射器：1mL。
3.8 平皿。
3.9 接種環。
3.10 載玻片。
3.11 小白鼠。
4 培養基和試劑
4.1 庖肉培養基：GB4789.28中4.67。4.2 卵黃瓊脂培養基：GB4789.28中4.68。
4.3 明膠磷酸鹽緩衝液：GB4789.28中3.23。
4.4 肉毒分型抗毒診斷血清。
4.5 胰酶：活力1∶250。
4.6 革蘭氏染色液：GB4789.28中2.2。
5 檢驗程式
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程式如下：註：①報告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。
②報告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。
③報告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。
如上所示，檢樣經均質處理後，及時接種培養，進行增菌、產毒，同時進行毒素檢測試驗。毒素檢測試驗結果可證明檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。
對增菌產毒培養物，一方面做一般的生長特性觀察，同時檢測肉毒毒素的產生情況。所得結果可證明檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
為其他特殊目的而欲獲純菌株，可用增菌產毒培養物進行分離培養，對所得純菌株進行形態、培養特性等觀察及毒素檢測，其結果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。
6 操作步驟
6.1 肉毒毒素檢測液狀檢樣可直接離心，固體或半流動檢樣須加適量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明膠磷酸鹽緩衝液，浸泡、研碎，然後離心，取上清液進行檢測。
另取一部分上清液，調pH6.2，每9份加10%胰酶(活力1：250)水溶液1份，混勻，經常輕輕攪動，37℃作用60min，進行檢測。
肉毒毒素檢測以小白鼠腹腔注射法為標準方法。
6.1.1 檢出試驗：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2隻，每隻0.5mL，觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射後24h內發病、死亡。主要症狀為豎毛，四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死於呼吸麻痹。
如遇小鼠猝死以至症狀不明顯時，則可將注射液做適當稀釋，重做試驗。
6.1.2 確證試驗：不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發病、死亡者，取樣分成3份進行試驗，1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min，1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻，煮沸10min；1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻即可，不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2隻，每隻0.5mL，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護存活，而唯有注射未經其他處理的混合液的小白鼠以特有症狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時要進行毒力測定及定型試驗。
6.1.3 毒力測定：取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩衝液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2隻，每隻0.5mL，觀察4d。根據動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力(MLD/mL或MLD/g)。例如：5倍、50倍及500倍稀釋致動物全部死亡，而注射5000倍稀釋液的動物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000～10000MLD/mL。
6.1.4 定型試驗：按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩衝液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1000MLD/mL的範圍，分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小鼠2隻，每隻0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩衝液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對照。能保護動物免於發病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。
註：①未經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。
②為爭取時間儘快得出結果，毒素檢測的各項試驗也可同時進行。
②根據具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。
④進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。
⑤試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束，以縮短觀察時間；唯有出現陰性結果時，應保留充分的觀察時間。
6.2 肉毒梭菌檢出(增菌產毒培養試驗)
取庖肉培養基3支，煮沸10～15min，做如下處理：
第一支：急速冷卻，接種檢樣均質液1～2mL；
第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續於60℃保溫10min，急速冷卻；
第三支：接種檢樣，繼續煮沸加熱10min，急速冷卻。
以上接種物於30℃培養5d，若無生長，可再培養10d。培養到期，若有生長，取培養液離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，方法同4.1，陽性結果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。
6.3 分離培養
選取經毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產毒培養物(必要時可重複一次適宜的加熱處理)接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養基表面覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，但G型菌無此現象。
根據菌落形態及菌體形態挑取可疑菌落，接種庖肉培養基，於30℃培養5d，進行毒素檢測及培養特性檢查確證試驗。
6.3.1 毒素檢測：試驗方法同4.1。
6.3.2 培養特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成2份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養48h，觀察生長情況及菌落形態。肉毒梭菌只有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長並形成具有上述特徵的菌落，而在需氧條件下則不生長。
註：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預溫37℃(流質蜂蜜)，或52～53℃(晶質蜂蜜)，充分攪拌後立即稱取20g，溶於100mL滅菌蒸餾水(37℃或52～53℃)，攪拌稀釋，以8000～10000r/min離心30min(20℃)，沉澱，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻，等分各半，接種庖肉培養基(8～10mL)各1支，分別在30℃及37℃下厭?跖嘌?d，按6.2進行肉毒毒素檢測。
