檢測方法
糖化血紅蛋白目前臨床實驗室中套用的糖化血紅蛋白檢測方法主要有兩大類: 一類方法基於糖化血紅蛋白與非糖化血紅蛋白所帶的電荷不同, 如離子層析法、電泳等方法; 另一類方法基於血紅蛋白上糖化基團的結構特點, 如親和層析、離子捕獲法和免疫法等。其中高效液相離子層析法(H PLC )被公認為金標法。
1. 離子層析法 離子層析法精密度高、重複性好且操作簡單, 被臨床廣泛採用。檢測原理由於血紅蛋白? 鏈N 末端纈氨酸糖化後所帶電荷不同, 在偏酸溶液中總糖化血紅蛋白( GH b) 及H bA 均具有陽離子的特性, 因此經過陽離子交換層析柱時可被偏酸的緩衝液平衡過的樹脂來吸附, 但二者吸附率不同, GH b正電荷較少吸附率較低, H bA 正電荷較多吸附率較高。用不同pH 的磷酸鹽緩衝液可以分次洗脫出GH b 和H bA, 用KCN 可將H b轉化為高鐵氰化血紅蛋白, 用分光光度計測定。或者得到相應的H b層析譜, 其橫坐標是時間, 縱坐標是百分比。HbA1c值以百分率來表示。現在大部分都用全自動測定儀測定,如日本TOSOH 公司生產的全自動糖化血紅蛋白分析儀曾套用於美國糖尿病控制和並發證試驗( DCCT) 研究, 其離子交換H PLC法是H bA1c檢測的金標準。當前推出的HLC- 723G7從開機到報告第一個結果僅需3. 6 m in, 標本無需前處理, 操作維護都非常方便, 是目前測試GH b精密度、準確性最高的方法。國內主要採用B io- Rex70陽離子樹脂微柱層析法, 其微柱可重複使用多次,更大型的儀器有SCIENTIFIC公司的Hb- Gold, 除可全自動測定糖化血紅蛋白外, 還可分離檢測血紅蛋白的600多種變異體和亞型, 用於地中海貧血等疾病的診斷。但其缺點是價格昂貴, 僅在一些已開發國家使用, 且容易受到如下干擾: 胎兒血紅蛋白(H B -F)與HbA1 c的帶電性很相近, 在離子交換HPLC分析圖上可能呈現一個獨立的H b- F 峰, 也可能與H bA1c 峰重疊( 視離子交換柱的分辨能力而定)。
2. 手工微柱法 手式微柱操作會受到人工因素影響, 可能會洗脫不完全或過度洗脫並受外界環境溫度的影響, 而某些血紅蛋白如H bF異常增加時, 也會與糖化血紅蛋白同時洗脫, 從而使結果產生偏差。目前有B io- Rad和西班牙B IOSYSTEM S等多家公司產品, 相應的儀器以英國DREW SCIENTIFIC公司DS 5糖化血紅蛋白儀為例( B io- Rad公司IASTA 亦為同一產品), 採用微柱法離子交換層析和梯度洗脫技術可全自動分離血紅蛋白的變異體與亞型, 除可測定糖化血紅蛋白外, 還可同時檢測出血紅蛋白S( H bS)與血紅蛋白C( H bC )的存在與否, 在計算糖化血紅蛋白值時會自動扣除變異體產生的影響, 從而使結果更為準確, 可靠, 變異係數( CV ) 值< 2%。同時該儀器配有專門的稀釋溶血器, 可直接進行全血操作, 5 m in即可報告結果, 並自動儲存樣品檢測結果, 層析柱價格也較為低廉, 適合於較多標本的醫院檢測,但由於手工操作層析時間和微柱的質量不易控制, 易產生操作技術誤差, 重複性欠佳。
3. 瓊脂凝膠電泳法 H b及H bA1帶正電荷, 電泳時向負極移動。因為H bA 的β 鏈N - 末端所帶電荷被糖基消除, 帶電量少於H bA, 等電點低, 泳動速度慢, 所以H bA1 即GH b本身帶紅色, 所以可直接比色或掃描。用H bA1 占H b的量來表示。毛細管電泳也能分離檢測糖化血紅蛋白和血紅蛋白的變異體。普通電泳法對H bA 和H bA1 分離效果不理想, 目前尚無商品化且具有批量樣本通過能力的儀器面世, 相當程度地限制了該方法的臨床套用。
4. 等電點聚集法 也是測定GH b的新技術, 它是在聚丙烯酞凝膠中加人載體兩性介質( 如am pho lin) 的薄板上形成一個由陽極到陰極逐漸增加的pH 梯度, 溶血液中各個組份將移動到各自的等電點的pH 位置上, 這樣就得到比一般電泳法更好的分劃效果和比較集中的色帶, 通過解析度高的微量光密度儀掃描, 可以準確地測定出各自組份的含量。由於它能夠分辨出一級結構不同的H bA、H bA c、H bF、H bS 及H bC等, 可完全避開各種物質的干擾, 是一種理想的方法, 但儀器價格相當昂貴, 難於用作常規檢測。
5. 親和層析 利用生物高分子能與相應的專一配基分子可逆結合的原理, 將配基通過共價鍵牢固地結合於固相載體上製得親和吸附系統, 帶有雜質的高分子分離目的物在一定條件下,能以某種次級鍵與已同相化的配基結合, 而雜質則不吸附, 除去雜質後變換條件, 又可以使待分離的高分子物質重新解離, 獲得純化。GHb的親和色譜載體是氨基苯硼酸瓊脂糖凝膠, 當總的GHb通過載體時, 穩定型GH b分子表面含葡萄糖的順式二糖醇部分與載體固定相上的硼酸基因呈配位特異結合, 其它非糖化Hb及不穩定型GHb, H bF等, 隨流動相(天門冬酞胺緩衝液)流出, 然後用另一種含糖或多經化合物流動相(山梨糖醇緩衝液)將GH b洗脫下來, 利用兩部分H b本身的顏色, 在415 nm 條件下測定並計算出親和色譜所測的GH b。
英國DREW SC IENT IFIC 公司的DST 糖化血紅蛋白分析儀是一種快速床邊糖化血紅蛋白儀。它採用硼酸親和層析法, 只需10 ul全血即可在4 m in 內快速分離檢測糖化血紅蛋白, 為臨床提供即時的化驗結果, 從而使醫生在患者就診的第一時間明確診斷並制定相應的治療方案, 特別適合於臨床科室使用, 尤其對於小兒患者而言更有優勢。其檢測結果也完全達到並超過臨床要求, CV值在5%以內。
優點: 操作簡單、快速、價廉, 特異性強, 不受異常血紅蛋白的干擾, 對經翻譯以後修飾的血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對不敏感, 對血標本儲存的時間也不象離子交換法那樣嚴格。缺點: 檢測結果為糖化血紅蛋白總量, 不能測試GH b的單一組份,且包含H bA1的糖化組份, 因此將親和色譜所測出的GH b 稱為總的GHb是不確切的, 嚴格來說是占不同百分數的各種GH b, 目前對其測定內容的命名國內外尚不統一, 目前日本化學工業株式會社所生產試劑盒稱為糖化一親和色譜GHb, 以便與其他方法所測H bA, 或H bAc相區別。但並不影響它作為可靠的糖代謝指標的價值。大量實驗還證明, 該法所測GH b 值與H PLC 等法所測H bA, H bA c及空腹、餐後2 h血糖均呈高度相關, 表明該法對糖尿病患者是一種較理想的病情監測指標。
6. 離子捕獲法 近發展起來的新方法, 代表儀器有Abbo tt的IMX, 其原理是糖化血紅蛋白與相應抗體結合後, 聯以螢光標記物, 形成一反應複合物, 再聯結帶負電荷的多聚陰離子複合物, 而在IMX 反應孔中的玻璃纖維預先包被了高分子的四胺合物, 使纖維表面帶正電, 使前述的反應複合物吸附在纖維表面, 經過一系列清洗後測定其螢光強度, 從而得到糖化血紅蛋白的濃度, 該方法適用於成批糖化血紅蛋自標本的檢測。
7. 免疫凝集法 糖化血紅蛋白與相應的單抗結合進而發生凝集反應, 通過測定吸光度來表示凝集量, 可用於全自動生化分析儀上進行測定。以免疫分析為基礎的儀器( DCA2000) 在最近幾年中得到推廣, 約在7 m in 內就能讀取數據, 要求對樣品成批試驗, 每次試驗均應使用一個新試劑盒, 操作前應注意混勻試劑。免疫比濁法重複性較好, 但易受脂肪血、黃疸等樣本因素影響, 抗交叉污染較差, 而且要求血紅蛋白在一定範圍之間才能達到較好的線性。
8. 金標免疫滲濾法(金標法) 免疫滲濾法, 操作較簡便, 目前代表儀器有挪威NycoCardReaderII特種蛋白多功能全定量金標檢測儀。
9. 化學發光法 採用離子捕捉免疫分析法, 套用抗原抗體反應原理, 聯以螢光標記物, 通過連線帶負電的多陰離子複合物, 吸附到帶正電的纖維表面, 經過一系列徹底清洗等步驟後, 測定螢光強度變化率, 計算濃度。採用專用試劑包和免疫發光分析儀,其檢測系統易於規範和重複, 可減少操作技術誤差, 檢測的靈敏度和特異性高, 批內、批間變異係數小, 回收率高, 準確度高, 交叉污染率小, 影響因素少。
10. 放射免疫法 優點: 精密度高、特異性強、快速、價格相對便宜, 可批量測試, 且不受各種干擾因素的影響。缺點: 目前對製備高效價的抗體尚存在許多困難, 仍處於研究中, 未能形成商品化試劑盒。
11. 酶法 原理為用特殊蛋白酶分解Hb, 3~ 5 m in內果糖基胺基酸從H b分離, 果糖基胺基酸氧化酶( FAOD )從果糖基胺基酸產生H2O2, H 2O2經POD與DA- 64反應, 選擇751 nm 測吸光度改變求得GH b濃度
操作方案
1、操作方法 （1）收集靜脈血、加入EDTA抗凝。（2）根據樣品數取試管若干，分別吸取400μl溶血劑加入各試管中。（3）分別吸取80μl標準或樣本放入上述各試管中，混合均勻。（4）放置5～10min，則製成了血紅蛋白樣本A3。
2、糖化血紅蛋白的製備及測定 （1）根據樣品的數量，取乾淨的試管若干，分別吸取3.0ml陽離子樹脂，放入各管中。（2）向上述試管中分別加入已預備的100μl血紅蛋白樣本（A3）。將層析柱插入試管中，使得橡皮塞高於液面至少1cm。（3）充分搖盪試管混合5～10min（最好使用渦鏇搖盪器，如果沒有則需劇烈搖盪20min。（4）然後慢慢推動層析柱進入試管，直到糖化血紅蛋白提取完全。（5）上清液倒入另一支試管或直接倒入比色杯進行比色。（6）以蒸餾水作空白在415nm調零。（7）讀取並記錄標準，樣品吸光度值。
3、總血紅蛋白測定 （1）根據樣品數量取試管若干，分別加入5.0ml蒸餾水。（2）加入20μl血紅蛋白樣本（A3）。混合均勻。（3）以蒸餾水作空白在415nm調零。（4）讀取並記錄各管吸光度值。
計算：糖化血紅蛋白吸光度 總血紅蛋白吸光度×10=糖化血紅蛋白%（正常值範圍6.0%～8%）。
臨床意義
糖化血紅蛋白臨床上，只有30%左右的糖尿病患者能做到定期監測糖化血紅蛋白。良好的血糖控制是預防併發症的關鍵，而血糖監測在很大程度上取決於患者本人的認知和行動。由於大部分患者選擇可靠性不高的日常監測手段，目前超過60%的2型糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制不理想。糖化血紅蛋白長期控制不穩定的影響是多方面的，它會改變紅細胞對氧的親和力，加速心腦血管併發症的形成；如果眼睛內的晶體被糖化，則會引發白內障。此外，它可引起腎小球基底膜增厚，誘發糖尿病腎病，並引起血脂和血粘度增高。糖化血紅蛋白升高，是心肌梗死、腦卒中死亡的一個高危因素。在男性患者中，糖化血紅蛋白每增加1%，死亡率的相對危險性增加24%，女性患者增加28%。一旦糖化血紅蛋白超過7%，發生心腦血管疾病的危險性就增加50%以上。
糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制水平沒有閾值，隨著糖化血紅蛋白水平的降低，越接近正常值，糖尿病的併發症降低越明顯，DCCT、UKPDS等國際大規模臨床試驗得出結論，證實糖尿病患者經強化治療後糖化血紅蛋白水平可以顯著降低，各種併發症風險也明顯減少。英國前瞻性研究證實糖化血紅蛋白每下降1%，糖尿病相關的死亡率降低21%；心肌梗死發生率下降14%；腦卒中發生率下降12%；微血管病變發生率下降37%；白內障摘除術下降19%；周圍血管疾病導致的截肢或死亡率下降43%；心力衰竭發生率下降16%。因此，糖化血紅蛋白對糖尿病患者來說是一項非常重要的監測指標，它的高低直接決定將來各種嚴重影響糖尿病患者生活質量的慢性併發症的發生和發展。糖尿病患者定期監測糖化血紅蛋白具有非常重要的意義，有助於幫助患者改善血糖控制水平，促進患者的血糖達標，從而減少併發症的發病率，從根本上改善糖尿病患者的生活質量。
糖化血紅蛋白增高對人體的影響是多方面的，它可改變紅細胞對氧的親和力，使組織與細胞缺氧，加速心腦血管併發症的形成；可引起腎小球增厚，誘發糖尿病腎病(DN)；還可引起血脂和血粘滯度增高，是心血管病發生的重要因素。因此，監測糖化血紅蛋白不論對糖尿病患者疾病控制情況，併發症的預測情況，還是糖尿病病人的篩選等方面都有重要的意義。美國1型糖尿病控制及併發症試驗(DCCT)和英國2型糖尿病控制與併發症(UKPDS)均把糖化血紅蛋白作為糖尿病的一個重要評價指南，且都充分肯定了強化治療在阻止血管併發症發生、發展的重要作用。
1是糖尿病患者血糖總體控制情況的指標
2有助於糖尿病慢性併發症的認識
3指導對血糖的調整
4對判斷糖尿病的不同階段有一定的意義
5區別應激性血糖增高和妊娠糖尿病(GDM)中的檢測意義
綜上，糖化血紅蛋白的檢測對糖尿病患者的整體情況有很重要的意義。臨床醫務工作者不能僅局限在對血糖的認識上來管理血糖，應綜合糖化血紅蛋白才能更好的控制血糖，預防併發症的發生。美國糖尿病協會(ADA)建議血糖控制滿意且穩定的糖尿病患者至少1年測2次糖化血紅蛋白；若血糖控制不滿意且需調整方案者，應一年測4次。另外計畫懷孕的糖尿病婦女，初期每月測一次糖化血紅蛋白，血糖控制滿意後，應每6～8周測1次，直到受孕。同時還應該注意各種貧血，出血性疾病，或用心得安、嗎飛、雙氫克脲塞等藥物可使糖化血紅蛋白下降，而用大量阿司匹林、維生素c腎功不全，甲亢者可使其增高。應綜合考慮，做到全面衡量患者的整體情況。但糖化血紅蛋白不能作為診斷糖尿病的依據，也不能取代糖耐量試驗，可作為糖尿病的普查和健康檢查的項目。
此外還要注意①對昏迷病人的鑑別：在腦血管急症時，由於應激反應可使血糖增高，但糖化血紅蛋白檢測正常。若糖化血紅蛋白增高預示患者處於高血糖狀態。②糖化血紅蛋白很高的患者要警惕酮症酸中毒的發生。③對妊娠糖尿病僅測定血糖是不夠的，一定要監測糖化血紅蛋白，並使其保持在8%以下。如此可避免巨大胎兒、死胎和畸形胎兒的發生。④指導治療：如已測定了某病人的糖化血紅蛋白，可推算出平均血糖的水平，再用推算值與同一標本的空腹血糖值對比，可預測出近期血糖控制的好壞。糖化血紅蛋白小於7.3%時，餐後血糖對糖化血紅蛋白的水平影響較大；當在7.3%—8.4%時，空腹和餐後血糖對糖化血紅蛋白的功效差不多；當大於8.5%時空腹血糖所扮演的角色更重要。因此，糖化血紅蛋白水平很高者需要更好的控制空腹血糖水平。所以，糖化血紅蛋白在7%—8%者要更多干預餐後血糖，減少低血糖反應；大於8%者要兼顧空腹和餐後血糖，小於8%側重改善餐後血糖。如若空腹血糖高於7.1mmol/L許多，糖化血紅蛋白大於8%，表示近期血糖控制不好，需調整治療方案。反之，若空腹血糖低於7.1mmol/L,甚至正常，糖化血紅蛋白小於8%,則表示近期血糖控制良好，本著“效不更方”的原則，治療方案不變。因此，同時測定血糖與糖化血紅蛋白可以更好地全面判斷病情，指導治療。
標準檢測
1.HbA1c檢測結果應當在全世界範圍內進行標準化，包括參考系統和結果報告。
2.新的IFCC參考系統是進行A1c檢測標準化的唯一有效的參考標準。
3.全世界範圍，A1c報告結果必須採用IFCC單位（mmol/mol），美國國家糖化血紅蛋白標準化計畫（NGSP）的單位（%）必須採用IFCC-NGSP換算公式進行計算。
4.如果正在進行的“平均血糖研究”得出了優先-特異的標準，那么由A1c檢測結果計算而得的A1c平均血糖（A1c Derived Average Glucose，ADAG）值應該作為A1c結果的一部分一併報告。
5.在指導臨床治療方面，血糖值和ADAG應該以IFCC單位及測得的NGSP單位表示。
