糖解作用
在糖解作用中，此分子是2-磷酸甘油酸在烯醇化酶（enolase）的催化下生成，是一個高能磷酸分子。接下來磷酸烯醇丙酮酸將會進入糖解作用的第10個，也是最後一個步驟中。
在糖解作用的最後步驟里，磷酸烯醇丙酮酸將會經由丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）的催化，使原本接在氧原子上的磷酸根轉移到ADP上，進而生成ATP以及丙酮酸。這個反應會放出大量的能量，是一個難逆的反應，其標準自由能變化是31.4 kJ/mol（在pH=7、濃度55.5M的水中）。此外，這個反應也需要鉀離子與鎂離子（或其他二價陽離子）的參與。
糖質新生
由於糖解作用的最後步驟是個難逆反應，因此在糖質新生的過程中，需要一個替代途徑，才能將丙酮酸還原成磷酸烯醇丙酮酸。首先丙酮酸必需要先在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase）的催化之下，消耗ATP分子並轉變成草醯乙酸（Oxaloacetate）。
之後草醋酸又會經由磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）的催化，生成磷酸烯醇丙酮酸，在這個反應中，會消耗掉GTP，並生成GDP與二氧化碳。
與前後反應不同的是，以上的兩個反應是在粒線體中進行。而且除了直接轉變之外，草醋酸還可以利用另一個需要更多步驟的途徑，來生成磷酸烯醇丙酮酸。此外，從磷酸烯醇丙酮酸的生成直到果糖-1,6-雙磷酸產生為止，中間的糖質新生過程皆是糖解作用的逆反應。
C4二氧化碳固定
在C4植物中，磷酸烯醇丙酮酸在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的作用下與二氧化碳反應生成草醯乙酸。
參考資料David L. Nelson & Michael M. cox. Lehinger. Principles of Biochemistry. 4th edition. Freeman. ISBN 0-7167-4339-6.Lubert Stryer原著；曾國輝編譯。《大學生物化學》。藝軒圖書出版。ISBN 957-616-120-7。
