簡介
【通用名稱】注射用重組人促紅素(CHO細胞)
拼音名：ZhusheyongChongzuRenCuhongsu(CHOXibao)
英文名：RecombinantHumanErythropoietinforInjection(CHOCell)
書頁號：2005年版三部－229
本品系由含有高效表達人紅細胞生成素(簡稱人促紅素)基因的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，經細胞培養、分離和高度純化後凍乾製成。含適宜穩定劑，不含防腐劑和抗生素。
1基本要求
生產和檢定用設施、原料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
2製造
2.1工程細胞
2.1.1名稱及來源
重組人促紅素工程細胞系由帶有人促紅素基因的重組質粒轉染的CHO-dhfr-(二氫葉酸還原酶基因缺陷型細胞)細胞系。
2.1.2細胞庫建立、傳代及保存
由原始細胞庫的細胞傳代，擴增後凍存於液氮中，作為主細胞庫；從主細胞庫的細胞傳代，擴增後凍存於液氮中，作為工作細胞庫。每次傳代不超過批准的代次。細胞系凍存於液氮中，檢定合格後方可用於生產。
2.1.3主細胞庫及工作細胞庫細胞的檢定
應符合“生物製品生產用動物細胞基質製備及檢定規程”規定。
2.1.3.1外源因子檢查
細菌和真菌、支原體、病毒檢查均應為陰性。
2.1.3.2細胞鑑別試驗
套用同工酶分析、生物化學、免疫學、細胞學和遺傳標記物等任一方法進行鑑別，應為典型CHO細胞。
2.1.3.3人促紅素表達量
應不低於原始細胞庫細胞表達量。
2.2原液
2.2.1細胞的復甦與擴增
從工作細胞庫來源的細胞復甦後，於含滅能小牛血清培養液中進行傳代、擴增，供轉瓶或細胞培養罐接種用。小牛血清的質量應符合規定(附錄XIIID)。
2.2.2細胞培養液
生產用細胞培養液應不含牛血清和任何抗生素。
2.2.3細胞培養
細胞培養全過程應嚴格按照無菌操作。細胞培養時間可根據細胞生長情況而定。
2.2.4分離純化
收集的培養液採用經批准的超濾法或其他適宜方法進行濃縮，多步色譜純化後製得高純度的重組人促紅素，即為人促紅素原液。除菌過濾後保存於適宜溫度，並規定其有效期。
2.2.5原液檢定
按3.1項進行。
2.3半成品
2.3.1配製與除菌
原液加入適宜穩定劑，並用緩衝液稀釋。除菌過濾後即為半成品。
2.3.2半成品檢定
按3.2項進行。
2.4成品
2.4.1分批
應符合“生物製品分批規程”規定。
2.4.2分裝及凍乾
應符合“生物製品分裝和凍乾規程”規定。半成品應及時分裝、冷凍。凍乾的全過程中，製品溫度應不高於30℃。
2.4.3規格
應為經批准的規格。
2.4.4包裝
應符合“生物製品包裝規程”規定。
3檢定
3.1原液檢定
3.1.1蛋白質含量
依法測定(附錄ⅥB第二法)。
3.1.2生物學活性
3.1.2.1體內法
依法測定(附錄ⅩB)。
3.1.2.2體外法
按酶聯免疫法試劑盒說明書測定。
3.1.3比活性
每1mg蛋白質應不低於1.2×10〈5〉IU。
3.1.4純度
3.1.4.1電泳法
依法測定(附錄ⅣC)。用非還原SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍染色，分離膠膠濃度為12.5%，加樣量應不低於10μg，經掃瞄器掃描，純度應不低於98.0%。
3.1.4.2高效液相色譜法
依法測定(附錄ⅢB)。親水矽膠體積排阻色譜柱，排阻極限300kD，孔徑24nm，粒度10μm，直徑7.5mm，長30cm；流動相為3.2mmol/L磷酸氫二鈉-1.5mmol/L磷酸二氫鉀-400.4mmol/L氯化鈉，pH7.3；上樣量20～100μg，于波長280nm處檢測，以人促紅素色譜峰計算理論板數應不低於1500。按面積歸一化法計算人促紅素純度，應不低於98.0%。
3.1.5分子量
依法測定(附錄ⅣC)。用還原型SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍R250染色，分離膠膠濃度為12.5%，加樣量應不低於1μg，分子質量應為36～45kD。
3.1.6紫外光譜掃描
依法測定(附錄ⅡA)，最大吸收峰279nm±2nm；最小吸收峰250nm±2nm；在320～360nm處無吸收峰。
3.1.7等電點
依法測定(附錄ⅣD)，使用pH值為3.0～5.0的兩性電解質，等電點應為pH3.3～4.3。
3.1.8唾液酸含量
每1mol人促紅素應不低於9.0mol(附錄ⅥC)。
3.1.9外源性DNA殘留量
每10000IU人促紅素應不高於100pg(附錄ⅨB)。
3.1.10CHO細胞蛋白殘留量
用雙抗體夾心酶聯免疫法檢測，應不高於0.10%。
3.1.11細菌內毒素檢查
每10000IU人促紅素應小於2EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗)。
3.1.12牛血清白蛋白殘留量
用酶聯免疫法檢測，應不高於0.01%。
3.1.13肽圖(至少每半年測定1次)
供試品經透析、凍乾後，用1%碳酸氫銨溶液溶解並稀釋至1.5mg/ml，依法測定(附錄ⅧE)，其中加入胰蛋白酶(序列分析純)，37℃±0.5℃保溫6小時，色譜柱為反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔徑30nm)，柱溫為45℃±0.5℃；流速為每分鐘0.75ml；進樣量為20μl；按下表進行梯度洗脫(表中A為0.1%三氟乙酸水溶液，B為0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液）。
3.1.14N-末端胺基酸序列(至少每年測定1次)
用胺基酸序列分析儀測定。N-末端序列應為：
Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。
3.2半成品檢定
3.2.1細菌內毒素檢查
每1000IU人促紅素應小於2EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗)。
3.2.2無菌檢查
依法檢查(附錄ⅫA)，應符合規定。
3.3成品檢定
除復溶時間和水分測定外，應按標示量加入滅菌注射用水，復溶後進行其餘各項檢定。
3.3.1鑑別試驗
按免疫印跡法(附錄ⅧA)或免疫斑點法(附錄ⅧB)測定，應為陽性。
3.3.2物理檢查
3.3.2.1外觀
應為白色疏鬆體，復溶後為無色澄明液體。
3.3.2.2復溶時間
加入標示量的滅菌注射用水，復溶時間應不超過2分鐘。
3.3.2.3可見異物
依法檢查(附錄ⅤB)，應符合規定。
3.3.2.4裝量差異
按附錄ⅠA中裝量差異項進行，應符合規定。
3.3.3化學檢定
3.3.3.1水分
應不高於3.0%(附錄ⅦD)。
3.3.3.2pH值
應為6.4～7.4或5.4～6.4(附錄ⅤA)。
3.3.3.3鈉離子含量
應不大於190mmol/L(附錄ⅦJ)。
3.3.3.4枸櫞酸離子含量
應不大於25mmol/L(附錄ⅦH第二法)。
3.3.3.5蛋白質含量
依法測定(附錄ⅥB第二法)，應符合經批准的蛋白質含量範圍。
3.3.4生物學活性
3.3.4.1體外法
按酶聯免疫法試劑盒說明書測定供試品體外活性(IU/m1)，根據標示裝量計算供試品生物學活性(IU/瓶)，應為標示量的80%～120%。
3.3.4.2體內法
按附錄ⅩB測定供試品體內活性(IU/ml)，根據標示裝量計算供試品生物學活性(IU/瓶)，應為標示量的80%～140%。
3.3.5無菌檢查
依法檢查(附錄ⅫA)，應符合規定。
3.3.6細菌內毒素檢查
每1000IU人促紅素應小於2EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗)。
3.3.7異常毒性檢查
依法檢查(附錄ⅫF小鼠試驗法)，應符合規定。
4保存、運輸及有效期
於8℃以下避光保存和運輸。自分裝之日起，按批准的有效期執行。
5使用說明
應符合“生物製品包裝規程”規定。
