原理及滿足條件
梯度洗脫的原理
流動相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，並使樣品種的所有組分可在最短時間內實現最佳分離。
具體地講，當樣品隨梯度起點的流動相進入色譜柱入口時，由於起點流動相中強洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強)因分配係數(k值)較高而滯留於色譜柱入口附近，幾乎未移動。一段時間後，B增加到一定數值，C1的k值達到足夠小(比如小於10)，其在柱中的移動速率明顯增大，並且隨著B的增加，其移動速率愈加快速，直到tC1時流出色譜柱，被檢測器檢測到並被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時的保留時間長很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰並未展寬，靈敏度仍處於較高水平。B持續增加，在隨後的某個時間點，C2的k值也降到10以下，C2的移動速率也開始變快，以與C1類似的方式於tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處於較高水平。
梯度洗脫特點
提高柱效，改善檢測器的靈敏度。當樣品中的一個峰的k值和最後一個峰的k值相差幾十倍至幾百倍時，使用梯度洗脫效果特別好。梯度洗脫中為保證流速的穩定，必須使用恆流泵，否則難獲重複結果。梯度洗脫常用一個弱極性的溶劑A和一個強極性的溶劑B。
梯度洗脫裝置示意圖2
梯度洗脫示意圖1如圖(兩個圖一種原理，前者為洗脫裝置和柱子之間封閉，適用於配備壓力泵的色譜柱，後者為洗脫裝置和柱子之間隔離開來，是梯度洗脫的簡易裝置。):兩個容器放於同一水平上，兩容器連通，B與柱相連，當溶液由B流入柱時，A中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩衝液的洗脫能力即成梯度變化。
洗脫要求
①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散;而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
梯度洗脫可分為低壓梯度(又稱為外梯度)和高壓梯度(又稱為內梯度)。
(1)低壓梯度裝置。低壓梯度是採用比例調節閥，在常壓下預先按一定的程式將溶劑混
合後，再用泵輸入色譜柱系統，也稱為泵前混合。
(2)高壓梯度裝置。由兩台(或多台)高壓輸液泵、梯度程式控制器(或計算機及接口板控
制)、混合器等部件所組成。兩台(或多台)泵分別將兩種(或多種)極性不同的溶劑輸入混合
器，經充分混合後進入色譜柱系統。
分級梯度洗脫
分級梯度洗脫是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶於水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合於電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用，稱為陰離子交換劑。
