當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時,切開的DNA兩條單鏈的切口,是平整的,這樣的切口叫平末端。
被限制性內切酶切斷的DNA分子片段,需要一種特殊的酶——DNA連線酶來縫合,恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E·coliDNA連線酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連線起來,不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連線。而T4DNA連線酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端,又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端,但連線平末端之間的效率比較低。
提高平末端連線效率的措施
①提高T4DNA連線酶的濃度;②提高DNA片段的濃度;③降低ATP濃度,以增強連線物與DNA結合;④加入多胺化合物,如亞精胺,降低DNA的靜電排斥力;⑤加濃縮劑,如大分子排阻物聚乙二醇(PEG)、強水化物三氯化六氨鈷等。