天蠶素抗菌肽

天蠶素抗菌肽

天蠶素(cecropins)是第一個被發現的動物抗菌肽,1980年,由Boman等從天蠶蛹中分離得到。

1、天蠶素抗菌肽是什麼?
天蠶素(cecropins)是第一個被發現的動物抗菌肽,1980年,由Boman等從天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37~39個胺基酸殘基,不含半胱氨酸,其N端區域具有強鹼性,可形成近乎完美的雙親螺鏇結構,而在C端區域可形成疏水螺鏇,兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區,多數多肽的C端被醯胺化,醯胺化對其抗菌活性具有重要作用。此後,人們相繼從家蠶、柞蠶、果蠅、麻蠅中分離到了cecropins類抗菌肽。1989年,Lee等人從豬小腸中分高到了cecropin P1,說明了cecropins可能在動物中廣泛存在。天蠶素(cecropins)對革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌具有很強的殺傷力,而對真菌和真核細胞沒有毒性。
2、抗菌肽與抗生素抗菌機理的區別
抗生素抗菌機制是抗生素與病原體特定部位的受體結合從而使病原體的正常結構遭到破壞或使某些生物合成受阻,以達到抑菌或殺菌的作用,當其作用的靶位點發生改變時,抗生素就會失去其抗菌作用。
關於抗菌肽的抗菌機制的認識主要集中在以下觀點:抗菌肽以物理的方式作用於細菌的細胞膜,使細胞膜穿孔,細胞質外溢而達到殺菌的目的。由於抗菌肽均具有疏水和親水的兩親性特徵,帶正電荷的分子與細胞膜磷脂分子上的負電荷形成靜電吸附而結合在細胞的磷脂膜上,隨後抗菌肽分子的疏水端插入細菌細胞膜的脂質膜中,進而牽引整個分子進入質膜,擾亂質膜上蛋白質和脂質原有的排列秩序,再通過抗菌肽分子間的相互位移而聚合形成跨膜離子通道,細胞質外流,細胞內離子大量丟失,細菌不能維持正常生命活動所需的胞內滲透壓而死亡。
3、抗菌肽殺傷作用的高度選擇性
抗菌肽只對原核生物細胞產生特異性的溶菌活性,對最低等的真核生物如真菌及某些植物的原生質體、某些腫瘤細胞等也有一定的殺傷力,而對人體正常的細胞則無損傷作用。這種特性的原因在於原核細胞和真核細胞結構尤其是膜結構的不同,真核細胞質膜含有豐富的膜蛋白和膽固醇,特別是後者的存在,使細胞膜趨於穩定,而且哺乳動物細胞中還存在高度發達的細胞骨架系統,其中的微絲、微管與質膜內層有著許多結合位點,這種結構是細胞維持特殊形態和滲透壓的首要因素,它的存在抵抗了抗菌肽的溶菌作用。用細胞鬆弛素將哺乳動物細胞中的骨架結構去除後,此細胞對抗菌肽的溶菌作用很敏感。此現象的意義在於許多癌細胞的細胞骨架系統與正常細胞相比是不發達的,體外實驗表明,對正常細胞無毒性濃度的抗菌肽可以殺死許多癌細胞株。
4、天蠶素抗菌肽的用途
現代研究認為,抗菌肽是最具潛力的抗生素替代品之一。而天蠶素又是目前研究比較清楚的抗菌肽。由於人工合成抗菌肽不僅技術瓶頸多、工藝複雜,且合成成本昂貴,不適宜大規模生產。單一提純物在使用時還可能有溶血性問題,所以現在套用在人上的天蠶素抗菌肽基本上都是通過誘導家蠶或榨蠶產生的天蠶素與這些物質的初級混合物,作為保健食品使用,其中含有的天蠶素抗菌肽是極微的。
飼用天蠶素抗菌肽要克服提純難、成本高的問題就必須藉助現代生物技術通過微生物的高效表達來實現。
5、飼用天蠶素抗菌肽CAD的研究開發
目前,國家飼料工業中心藉助國家科研基金的支持已經成功解決這一問題。譙仕彥博士和祝髮明博士領導的團隊根據抗菌肽CAD穿梭載體構建的特點,採用一種簡便、高效的載體構建方法。此法是在PCR引物設計時,在目的片段5′端加上隨機設計的接頭,利用PCR克隆目的片段,再用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性處理PCR克隆目的片段,產生多個首尾相匹配的粘性末端,進行多片段定向連線、轉化、重組子鑑定。利用此法成功構建了高拷貝大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體,為下一步天蠶素CAD的合成打下了堅實基礎。
他們在啟動子和高效Tat分泌途徑信號肽篩選中利用青黴素醯化酶(PGA)作為報告蛋白,通過枯草桿菌168菌株基因組的序列分析,對可能具有Tat分泌途徑的28個信號肽進行篩選,成功得到了1個非誘導型強啟動子和3個高效Tat途徑分泌功能的信號肽。並根據抗菌肽CAD基因合成與表達特點,利用枯草桿菌密碼子偏好性將天蠶素族抗菌肽A、D基因融合,經過多重PCR法成功合成了天蠶素CAD基因;再通過設計抗菌肽CAD在枯草桿菌中表達的研究方案,成功構建了在枯草桿菌1A747中高效分泌表達的抗菌肽CAD的表達載體,表達產物為37個胺基酸、分子量為3.72kD的抗菌肽。解決了抗菌肽基因工程菌安全性問題。
6、天蠶素抗菌肽CAD的商品化之路
為了驗證產品的效果,研究團隊利用小規模發酵罐進行了中試試驗。結果表明,通過對抗菌肽CAD重組枯草桿菌的液態深層發酵培養基及發酵條件最佳化篩選,獲得了7000U/ml的殺菌效價以及蛋白CAD表達量為上清總蛋白含量39.9%的最佳發酵條件。利用BCA蛋白定量測定法在重組枯草桿菌和1A747菌的發酵上清液中測得蛋白CAD的分泌表達含量為1.08mg/ml。此含量為國內外報導中最高量。
抑菌試驗表明抗菌肽CAD對畜禽主要致病菌沙門氏桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌、糞鏈球菌、金黃色葡糖球菌等12種病菌具有很強的殺傷作用,但是對乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌沒有傷害。
目前這一技術體系已經實現向企業的轉移,由北京中農穎泰生物技術有限公司進行商品化生產,在河南林州生產基地中試效果令人滿意,現已經生產出天蠶素抗菌肽CAD產品。

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