實驗目的
通過本實驗學習PCR反應的基本原理，掌握PCR的基本操作技術以及瓊脂糖凝膠電泳技術。
反應原理
PCR用於擴增位於兩端已知序列之間的DNA區段，即通過引物延伸而進行的重複雙向DNA合成。基本原理及過程如下：
PCR循環過程中有三種不同的事件發生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩定DNA聚合酶進行DNA合成。
1． 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2． 退火：在體系溫度降至37-65℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合，使引物與模板鏈3’端結合，形成部分雙鏈DNA，即退火階段。
3． 延伸：體系反應溫度升至中溫72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向複製出互補DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25～30個循環後DNA可擴增106～109倍(應該是十的六次方至十的九次方，是百度無法打出科學計數法，因此寫成了106~109）。
典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩衝液、dNTP、MgCl2、兩條合成的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶（Taq酶是從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分離出的具有熱穩定性的DNA 聚合酶。 對於PCR的套用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量套用，並逐步套用於臨床。 ）。
瓊脂糖凝膠電泳原理
瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定於瓊脂糖的濃度。DNA分子在鹼性環境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA，其分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數值成反比關係。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發射螢光。EB可與DNA分子形成EB-DNA複合物，其發射的螢光強度較游離狀態EB發射的螢光強度大10倍以上，且螢光強度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 ng以上的DNA。
實驗步驟
1．模板DNA的抽提：實驗一所得的水稻基因組DNA。2．PCR操作 (在冰上操作)：（1）PCR反應混合液的配製：反應體系25 µL, 在無菌的0.2 mL離心管中按下列操作程式加樣：（2）將反應混合液混勻, 然後每個PCR管中分裝24 µL反應混合液，再加1 µL模板DNA，最後加1滴石蠟油，防止水分蒸發, 然後稍離心。（3）將PCR管放到PCR熱循環儀中，按下列程式開始循環：（4）注意事項由於PCR靈敏度非常高，所以應當採取措施以防反應混合物受痕量DNA的污染。a. 所有與PCR有關的試劑，只作PCR實驗用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。c. 每加一種反應物，應換新的槍頭（加樣器的塑膠吸嘴的俗稱）。3．PCR產物的檢測：瓊脂糖濃度（1.2%）；EB濃度（5 µl / 100 ml TBE）（1）制膠（以150 mL為例）a. 稱取1.8 g 瓊脂糖，加入150 ml 的TBE緩衝液（pH 8.0），搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。b. 電爐上加熱，至瓊脂糖完全溶解；然後在天平上加蒸餾水至原重量;c. 用凝膠將制膠板兩端封好，插入適當的梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃），倒入其中，直至厚度為4～6 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30~ 45 min)；d.將制膠板置於電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。（2）點樣a. 將2.0 µl 溴酚藍加入到PCR產物中，然後稍微離心；b. 每孔點樣10.0 µl，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。（3）電泳打開電源開關，調節電壓至3~5 V/cm(約100 V)，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約1小時後即可觀察。（4）染色將電泳好的凝膠放入含EB的水溶液中, 染色15-20分鐘。（5）觀察將電泳好的膠置於紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據條帶粗細，可粗略估計該樣品DNA的濃度。如同時有已知分子量的標準DNA進行電泳，則可通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（6）注意事項a. 煮膠時，膠液的量不應超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。b. 煮好的膠應冷卻至50℃左右時再倒，以免制膠板變形，並減少漏膠的機會。c. 倒膠注意厚度（4-6 mm），充分凝固後再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固後，放入4℃冰櫃10多分鐘，以加速膠的凝固。d. 加樣前趕走點樣孔中的氣泡，點樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。e. 一般情況下不必每點一個樣品都換槍頭，吸電泳緩衝液洗幾次即可再點下一個樣品。凝膠中含有EB，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應集中處理，勿亂丟。
