簡介
例如，醫藥研發中有個關鍵環節，就是動物實驗。為了研究治療癌症的藥物，要有癌症的小鼠模型;為了研究糖尿病，要有糖尿病的小鼠模型。而把小鼠所有的約三萬個基因中的一個或幾個基因敲除後，培養出的小鼠，就成為適合藥物臨床實驗的動物模型，可以模仿人類患者進行研究治療。這些動物是在生物醫藥產業鏈中非常重要的一環。
基因敲除簡介
基因敲除是自80年代末以來發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除主要是套用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，新的原理和技術也逐漸被套用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達到基因敲除的目的。
原理和方法
1.利用基因同源重組進行基因敲除
基因敲除是80年代後半期套用DNA同源重組原理髮展起來的。80年代初，胚胎幹細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。
2.誘導性基因敲除也是以Cre/loxp系統為基礎，但卻是利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性，從而在1oxP動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現死胎或動物出生後不久即死亡的現象。常見的幾種誘導性類型如下：四環素誘導型；干擾素誘導型;激素誘導型;腺病毒介導型。
基因敲除小鼠製作技術及各自特點
近幾年來，製備動物模型的基因修飾技術層出不窮，這不僅包括傳統ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9，還有TetraOne基因敲除新技術。我們將對這四種技術的原理、特點、缺陷、未來發展趨勢作系統的介紹和對比，供您的科研選擇參考。
1、傳統ES打靶基因敲除：技術成熟、修飾準確、效果穩定，製作基因敲除小鼠周期長達一年
基因敲除小鼠基於胚胎幹細胞的同源重組技術俗稱"傳統的基因打靶技術"。因具有技術成熟、修飾準確、效果穩定等優點而受到眾多科學家一致好評，此外，世界上所有重要的的小鼠動物模型均通過此技術製備。儘管新興核酸酶敲除技術如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等相繼出現，但基於胚胎幹細胞的同源重組技術依然是唯一可以滿足所有基因組修飾要求的技術。
基因打靶就是通過同源重組技術將外源基因定點整合進靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的。基因打靶技術目前已被廣泛認為是一種理想的特定修飾與改造生物體遺傳物質的最佳方法，其中包括了多種不同的基因敲除和敲入系統，特別是條件性和誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因在時間和空間上的靶位修飾更加明確、效果更加精確可靠。
2、TetraOne基因敲除：技術成熟、修飾準確、效果穩定，製作基因敲除小鼠周期只需6個月
TetraOne基因敲除小鼠 TetraOne基因敲除是賽業生物科技推出的新技術，沿用胚胎幹細胞同源重組的技術體系，採用獨特的建系和基因改造技術建立了具有遺傳優勢的TetraOneES細胞系，通過胚胎髮育前期的顯微注射，使TetraOneES細胞100%代替內源ES細胞，實現跨越"嵌合體"階段一步獲得F1代小鼠的基因打靶專利技術。
TetraOne技術是基於胚胎幹細胞技術的金標準，通過同源重組技術將外源基因定點整合進靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造基因組某一基因的目的。同時TetraOne技術還具有核酸酶技術周期短的優勢，將傳統ES打靶技術的周期縮短一半，並且不會像核酸酶技術一樣帶來脫靶效應和馬賽克現象，在核酸酶技術沒有成熟之前，TetraOne技術將是研究者最佳的選擇。
3、TALEN基因敲除：製作基因敲除小鼠周期短4-6個月，但存在馬賽克現象和脫靶現象
TALEN技術是一種新的分子生物學工具。科學家發現，來自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結合域的胺基酸序列與其靶位點的核酸序列有恆定的對應關係。利用TAL的序列模組，可組裝成特異結合任意DNA序列的模組化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經常受上下游序列影響等問題，且具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。但因為脫靶的問題，利用TALEN技術進行小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統技術。加上存在馬賽克現象，所以在做基因敲入（KI）和其他套用時候也必須謹慎的進行檢測。
4、CRISPR/Cas9基因敲除：周期短4-6個月，但存在馬賽克現象和脫靶現象
CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是最新出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。CRISPR是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防禦機制。在這一系統中，crRNA（CRISPR-derivedRNA）通過鹼基配對與tracrRNA（trans-activatingRNA）結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元複合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪下雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠和大鼠基因組特定基因位點進行精確編輯，目前已經成功套用於大小鼠基因的KO/KI模型製備，其原理也是對目的片段產生特異的切割後，修復過程中產生移碼突變或者是片段缺失，或者是在切開位置產生片段插入等現象。
