單細胞全基因組擴增試劑盒:單細胞全基因組擴增試劑盒產品說明書目錄規格及成 -百科知識中文網

單細胞全基因組擴增試劑盒產品說明書

規格及成分

本單細胞全基因組擴增試劑盒由DNA提取和全基因組擴增試劑組合而成，可用於10次(Cat:YK001A)或50次全基因組擴增反應(Cat:YK001B)。

成分	YK001A（10次包裝）	YK001B（50次包裝）
細胞裂解液（不包含酶）	100µL	300µL
細胞裂解酶	10µL	30µL
預擴增buffer（不含酶）	300µL	750µLx2
預擴增酶	10µL	50µL
擴增buffer（不含酶）	300µL	750µLx2
擴增酶	8µL	40µL

組分說明：
細胞裂解液（不包含酶）標記：CellLysisBuffer
細胞裂解酶標記：CellLysisEnzyme
預擴增buffer（不含酶）標記：Pre-AmpBuffer
預擴增酶標記：Pre-AMPEnzymeMix
擴增buffer（不含酶）標記：AmplificationBuffer
擴增酶標記：AmpEnzymeMix

儲存方法

試劑盒內的所有組分，可在-20℃儲存十二個月，產品保質期標記於包裝盒的標籤上。用時請將細胞裂解酶、預擴增酶和擴增酶置於冰浴中，其他組分可在用前置於冰上解凍，建議您將試劑盒內的組份按需求進行分裝，避免反覆凍融。

預期用途

單細胞全基因組擴增試劑盒只用於研究目的；
單細胞全基因組擴增試劑盒不得向第三方轉讓，不得再銷售或改裝銷售，不得用於商業服務；
未經江蘇億康基因科技有限公司授權，不得用於商業產品的製造。

安全信息

利用本試劑盒進行實驗操作時，請穿著實驗服，戴好一次性手套和防護眼鏡，務必做好防護措施。如需更多信息，請查閱材料安全數據表。

自備材料

PCR儀
PCR管
移液器
移液器吸頭
製冰機
微型離心機
-20°C冰櫃
漩渦混和儀
紫外分光光度計
無核酸酶水
1XPBSbuffer

產品簡介

單細胞全基因組擴增試劑盒能夠在4小時內，從單細胞或者等量DNA中有效擴增出2-5µg的全基因組DNA。本試劑盒也可用於其他DNA模板量有限的情況，例如，少於百個細胞或低於ng級的DNA。對於大多數的哺乳動物細胞，例如，單個胚胎分裂球、極體、單細胞、精子，本試劑盒均可獲得95%以上的基因擴增成功率，並可實現AT-GC富集區的成功擴增。本試劑盒可從微量樣本中進行高度重複的擴增，qPCR的Ct值經多個單細胞重複反應後均可得到約為0.95的相關係數。本試劑盒能夠擴增90%以上的基因座，產物可用於多個分析平台，例如實時定量PCR和高通量測序。

產品特點

• 哺乳動物單細胞經擴增後可獲得2-5µg的DNA產物；
• 單管操作、3步完成、僅需4小時、中間產物無需純化；
• 可從流式分選出的細胞或0.5pg級DNA中擴增出全基因組DNA，且成功率達95%以上；
• 可在AT-GC富集區得到準確、高重複度的連續擴增結果；
• 僅存在<10%的基因座丟失及等位基因丟失。

基本原理

單細胞全基因組擴增試劑盒能夠實現高度均一的全基因組擴增，這種方法是基於多次退火環狀循環擴增（MALBAC）技術[1]，該技術首先利用獨特的具有鏈置換活性的DNA聚合酶進行準線性的全基因組預擴增，隨後通過PCR進行指數式擴增，為下游分析提供充分的實驗材料。

下游套用

經本試劑盒擴增後的DNA產物可用於多種下游分析平台：
•基因突變檢測
•SNP基因分型
•CNV全景圖和非整倍體檢測
•全基因組和外顯子測序
•實時定量PCR
•分子克隆
•微陣列比較基因組雜交

研究領域

單細胞全基因組擴增試劑盒的適用範圍十分廣泛，多種原始材料和微量樣品均可通過該試劑盒進行全基因組擴增，包括基因組DNA、新鮮或乾燥的血液、新鮮或冷凍的組織、司法痕量物證等材料，具體如下：

樣品材料
（細胞/DNA）

研究領域

樣品材料
（細胞/DNA）

研究領域

人和動物

生物標誌物研究（CNVs、SNVs）

體外受精胚胎植入前基因測序

轉基因動物基因分型

胚胎和幹細胞研究

單精子分型

腫瘤

體細胞遺傳變異分析

腫瘤進化和發展

腫瘤幹細胞

循環腫瘤細胞

細菌

宏基因組學研究

微生物基因分型

植物

氣孔研究

花粉分析

樣本要求

樣本數量

本試劑盒是針對單細胞的全基因組擴增設計的，同時適用於起始模板量為單染色體或範圍在0.5pg級至1ng級的基因組DNA。

樣品收集方式

通過流式分選，緩衝液稀釋和顯微操作等方式獲得的單細胞均可利用本試劑盒進行全基因組擴增。雖然活細胞擴增的結果較為理想，但本試劑盒對於經過多聚甲醛固定或雷射微切割的樣品，同樣適用。

樣本預處理

為減少細胞準備過程中DNA的污染，建議您在實驗前對細胞進行清洗，清洗液為不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液，保證帶入後該實驗中的PBS溶液的體積不得超過1µL.

實驗準備

1. 預擴增樣品準備區的隔離
• 為避免樣品受外界因素干擾或DNA擴增產物的污染，在擴增前，預擴增樣品的準備過程需在單獨隔離的實驗室或專門工作區完成，並預備專用的實驗材料和儀器，例如，移液器、移液管、PCR管、1.5mL的離心管、離心管架、離心機、漩渦混和儀和實驗服等；
• 請將DNA擴增產物與預擴增試劑分開儲存；所有的下游分析處理，如DNA純化、測序前的準備工作，請在另一實驗室中進行。
2. 移液器吸頭
由於單細胞全基因組擴增的整個過程都在同一PCR管中進行，因此，在操作過程中，請避免移液器吸頭接觸液體，以免因操作不當，將單細胞或DNA裹挾出反應體系；添加規定體積的液體時，請沿管壁小心添加，請勿吹打PCR管中液體；PCR前，請進行短暫離心，以保證反應體系中的液體混合均勻。
3. 對照組DNA樣品(5μL)
建議您利用30pg的基因組DNA作為陽性對照
• 利用無核酸酶水將DNA濃存儲液稀釋為30pg/μL的DNA，作為陽性對照；
• 取30pg/μLDNA溶液1μL，加入含4μLCellLysisBuffer的PCR管中。

操作流程

具體步驟

細胞裂解
1.根據反應的數量（N），混合CellLysisBuffer和CellLysisEnzyme，用於準備細胞裂解混合液。

細胞裂解混合液	體積
CellLysisBuffer(藍蓋)	5µLxN
CellLysisEnzyme(藍蓋)	0.1µLxN
總體積	5.1µLxN

2.將單細胞收集在含有5µL細胞裂解混合液的PCR管中（含有單細胞樣本的PBS溶液體積不得超過1µL）。

3.在預熱的PCR儀中孵育樣本，條件如下：

循環	溫度	時間
1	50℃	50min
	80℃	10min
	4℃	forever

MALBAC預擴增
4.根據反應的數量（N），混和Pre-AmpBuffer和Pre-AmpEnzymeMix，用於準備預擴增混合液。

預擴增混合液	體積
Pre-AmpBuffer(綠蓋)	30µLxN
Pre-AmpEnzymeMix(綠蓋)	1µLxN
總體積	31µLxN

5.在5µl的細胞裂解樣品或對照組DNA樣品中加入30µL預擴增混合液（此時反應總體積為35µL）。
6.在PCR儀中孵育，反應條件如下：
7.立即進行下一步指數式擴增

指數式擴增：
8.根據反應的數量（N），混合AmplificationBuffer和AmpEnzymeMix，準備擴增混合液。
9.在35µl的預擴增混合液中加入30µl擴增混合液（此時溶液總體積為65µl）。
10.在PCR儀中孵育，反應條件如下：
*對於100pg的gDNA，我們建議設定14個循環；對於流式分選的單細胞，設定17個循環；對於單染色體，設定19-21個循環；對於其他種類的細胞或其他方式獲得的樣本，建議在PCR前，對循環次數進行最佳化。
11.擴增後，將產物純化，於–20℃保存。
擴增產物
單細胞或等量DNA可通過單細胞擴增反應，從每65µL的反應體系中，獲得範圍在300-2000bp之間的擴增產物2-5µL，產物電泳如圖2所示。
單細胞通過本試劑盒能夠擴增出範圍在300-2000bp大小的終產物。M：DM2000DNAladder,購自康為世紀，1:陰性對照；2:陽性對照，30pg/µL的人類基因組DNA；3:單細胞擴增產物；4:單細胞擴增產物（重複）。

參考文獻

1.C.Zong*,S.Lu*,A.R.Chapman*,X.S.Xie.Genome-WideDetectionofSingleNucleotideandCopyNumberVariationsofaSingleHumanCell.Science338,1622-1626(2012)
2.S.Lu*,C.Zong*,W.Fan*,M.Yang*,etal.,ProbingMeioticRecombinationandAneuploidyofSingleSpermCellsbyWholeGenomeSequencingusingMALBA.Science338，1627-1630(2012)

問題解決方案

無擴增產物
樣品在收集過程中丟失	確認樣品在收集過程中，不會因操作不當，造成意外丟失
聚合酶抑制劑	起始樣本中含有的聚合酶抑制劑可能是導致全基因組擴增反應失敗的原因，具體操作方法請參閱第7頁中樣本預處理方法
酶失活	試劑盒中所有的組份都應該在-20℃的條件下保存；整個操作過程需在冰上進行
擴增產物含量低
樣品中含有聚合酶抑制劑	實驗前應對細胞進行清洗，具體方法請參閱第7頁中樣本預處理方法
基因組DNA降解	避免細胞因儲存方法或準備方法不當造成DNA的降解
陰性對照產生了與單細胞全基因組擴增相似的產物
試劑被外源性DNA污染	避免試劑盒的組份與外源性的DNA接觸，並利用專門的實驗材料進行單細胞全基因組擴增，具體信息請參閱第七頁的實驗準備細節
操作台被外源性DNA污染	利用專門的防核酸污染試劑徹底清理操作台
陰性對照溶液被外源性DNA污染	利用新的陰性對照溶液

技術支持

如需技術支持和其他服務請與江蘇億康基因科技有限公司聯繫
E-mail:[email protected]
電話：+86-010-5695-3059

單細胞全基因組擴增試劑盒

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