單分子測序

技術是基於邊合成邊測序的思想，以SMRT晶片為載體進行測序反應。 基因組測序由於具有讀長長的特點，SMRT 株霍亂菌株的基因組進行了測序研究，並與其他23

單分子測序平台介紹

本文主要介紹單分子測序平台的基本內容。

並行單分子合成測序技術

Helicos Biosciences 是第一個設計開發單分子測序方法( tSMSTM) 技術平台的公司，其基礎主要來自於Braslavsky 等人的研究。主要是利用合成測序理論，測序時首先將待測序列打斷成小片段並在3'末端加上polyA ，並用末端轉移酶阻斷，同時在玻璃晶片上隨機固定多個polyT引物( 其末端皆帶有螢光標記) ，將小片段DNA 模板與檢測晶片上的polyT 引物進行雜交並精確定位，通過成像來精確定位雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點; 逐一加入螢光標記的單色末端終止子及聚合酶的混合液孵育，洗滌，利用全內反射顯微鏡( total internal reflection microscopy，TIRM)進行單色成像，之後切開螢光染料和抑制基團，洗滌，加帽，允許下一個核苷酸的摻入。通過摻入、檢測和切除的反覆循環，就可以實現實時測序。由於該技術採用了Cy5 ( 吲哚-5-菁) 螢光基團具有很好的光穩定性、高水溶性和高螢光效率，激發波長在647nm 處) 和靈敏的監測系統，能夠直接記錄到單個鹼基的螢光，從而克服了其他方法須同時測數千個相同基因片段以增加信號亮度的缺陷。

單分子實時合成測序技術

SMRT 技術是基於邊合成邊測序的思想，以SMRT晶片為載體進行測序反應。SMRT晶片是一種帶有很多零模式波導孔( zero-mode waveguides，ZMW) ( 厚度為100 nm) 的金屬片，ZMW 是一種直徑只有幾十個納米的孔，由於其底部上的小孔短於雷射的單個波長，導致雷射無法直接穿過小孔，而會在小孔處發生光的衍射，形成局部發光的區域，即為螢光信號檢測區，該區域內錨定有DNA 聚合酶。測序時將基因組的DNA打斷成許多小的片段，製成液滴後將其分散到不同的ZMW 納米孔中。當ZMW 孔底部聚合反應發生時，被不同螢光標記的核苷酸會在小孔的螢光探測區域中被聚合酶滯留數十毫秒，螢光標記會在雷射束( Excitation) 的激發下發出螢光，根據螢光的種類就可以判定dNTP 的種類，反應完成後螢光標記會被聚合酶切除而彌散出ZMW 小孔，其它未參與合成的dNTP由於沒進入螢光信號檢測區而不進入螢光信號檢測區。SMRT 測序時，樣品準備過程涉及到樣品DNA 的打斷、末端補齊、連線接頭、測序這幾個步驟。測序中需要的樣品量很少，樣品準備中所用的試劑也很少，而且測序過程中省去掃描和洗滌的過程，所以測序所花的時間較少。

納米孔單分子技術

Oxford Nanopore Technologies 公司研發的測序技術完全不同於前兩種測序技術，其核心就是將在某一面上含有一對電極的特殊的脂質雙分子層置於一個微孔之上，該雙分子層中含有很多由α溶血素蛋白組成的納米孔中結合一個核酸外切酶。當DNA 模板進入孔道時，孔道中的核酸外切酶會“抓住”DNA 分子，順序剪下掉穿過納米孔道的DNA鹼基，每一個鹼基通過納米孔時都會產生一個阻斷，根據阻斷電流的變化就能檢測出相應鹼基的種類，最終得出DNA 分子的序列。納米孔單分子測序技術的一大優勢就是儀器構造簡單使用成本低廉; 因為它不需要對核苷酸進行標記，也不需要複雜的光學探測系統( 如雷射發射器和CCD信號採集系統等) ，能直接對RNA 分子進行測序。同時由於它是直接檢測每一個鹼基的特徵性電流，因而能對修飾過的鹼基進行測序，這一點對於表觀遺傳學研究具有極高的價值; 缺點就是它採用的是水解測序法，不能進行重複測序，因而無法達到一個滿意的測序精確度。

單分子測序技術的套用

由於單分子測序具有通量更高，儀器和試劑相對便宜、操作簡單等的優勢而比第二代測序技術有更廣闊的套用空間。

基因組測序

由於具有讀長長的特點，SMRT 測序平台在基因組測序中能降低測序後的Contig 數量，明顯減少後續的基因組拼接和注釋的工作量，節省大量的時間。Christophern 等僅僅用0． 5 × 的PacBio RS 系統長度的數據與38 × 的二代測序( NGS) 的測序數據，對馬達加斯加的一種指猴基因組進行拼裝，大幅度提高了數據的質量和完整度，同時藉助Pacbio RS 的幫助將原有的Contig 數量減少了10 倍。David A． 等利用PacBioRS 平台和C2 試劑通過全球合作幾天內就完成了從德國大腸桿菌疫情中獲得的大腸桿菌樣品以及近似菌株的測序和數據分析，最終獲得了2 900bp 的平均讀長以及99． 998% 的一致性準確度。在對霍亂病菌的研究中，第三代測序技術已初現鋒芒。研究人員對5 株霍亂菌株的基因組進行了測序研究，並與其他23 株霍亂弧菌的基因組進行對比。結果發現海地霍亂菌株與2002 年和2008 年在孟加拉國分離得到的變異霍亂弧菌El Tor O1 菌株之間關係密切，而與1991 年拉丁美洲霍亂分離株的關係較遠。相對NGS 的優勢就是能更快獲得結果，因此該系統在鑑定新的病原體和細菌的基因組測序方面得到很廣泛的套用。

甲基化研究

SMRT 技術採用的是對DNA 聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法，聚合酶合成每一個鹼基，都有一個時間段，而當模板鹼基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，使帶有修飾的鹼基兩個相鄰的脈衝峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大於1，由此就可以推斷這個位置有修飾。甲基化研究中關於5-mC 和5-hmC( 5-mC 的羥基化形式) 是甲基化研究中的熱點。但現有的測序方法無法區分5-mC 和5-hmC。美國芝加哥大學利用SMRT 測序技術和5-hmC 的選擇性化學標記方法來高通量檢測5-hmC。通過聚合酶動力學提供的信息，可直接檢測到DNA 甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC 和5-hmC，為表觀遺傳學研究打開了一條通路。

突變鑑定( SNP 檢測)

單分子測序的解析度具有不可比擬的優勢，而且沒有PCR 擴增步驟，就沒有擴增引入的鹼基錯誤，該優勢使其在特定序列的SNP 檢測，稀有突變及其頻率測定中大顯身手。例如在醫學研究中，對於FLT3 基因是否是急性髓細胞白血病( AML) 的有效治療靶標一直存在質疑。研究人員用單分子測序分析耐藥性患者基因，意外發現耐藥性與FLT3 基因下游出現的稀有新突變有關，重新證明了FLT3 基因是這種最常見白血病—急性髓細胞白血病( AML) 的有效治療靶標，打破了一直以來對於這一基因靶標的疑惑。憑藉PacBio 平均3 000bp的讀長，獲得了更多基因下游的寶貴信息，而基於單核酸分子的測序能夠檢測到低頻率( 低至1%) 罕見突變，正是這項成果的關鍵所在。