同源篩分 Homologous Screening
按預定目標就某種特定性質,對動物消化道內微生物進行分離、篩選,從而得到符合要求的優良菌株;確保篩選到的優良菌株再次導入同種動物體內時可以快速適應其消化道環境、迅速生長繁殖,並在短期內產生相應的促進生長、調節免疫等效果。
意義
現階段,微生態生產企業產品水平差距較大,產品繁雜,不好識別,市場處於混亂階段,生產出的好產品不多。例如,現在市場上的產品標示微生物含量在10
億到幾千億之間,在飼料中的添加量也在10-1000g/噸之間不等,標示的同為枯草芽孢桿菌,為什麼添加量有如此大的差別呢?“南橘北枳”的故事大家耳熟能詳,南方香甜的橘移植淮河之北就會變成苦澀的難於入口的枳,南方的橘子之所以到了北方就發生品質的變化,是因為生長環境的變化而“異化”或者“變質”,造成了南方橘子到北方後“水土不服”。同樣的,微生態製劑的菌種也會因為環境條件不同而發生變異變化,同樣使得其本身的優點不能夠完全的表現出來。
益生菌功效的選擇標準比其分子生物學潛在性能更加重要,因為促進健康的功效可能是種族特異性的。選擇益生菌的出處應該是正常的腸道棲息群,因為益生菌已經適應了宿主本身的消化系統:經過胃中嚴苛的酸性條件,在消化酶作用下和蠕動的腸道環境下得以存活;對膽汁鹽、本體免疫機制和飲食規律具備了抗性;與其他腸道細菌間建立了內在關係,這些都將幫助益生菌再次導入同類宿主中快速達到其作用位點並發揮作用。這種從消化道內分離出來最終回歸到動物消化道內的菌種分離篩選的過程,我們簡稱做同源篩分。
萌發條件
同源篩分菌株萌發條件簡單,活力更強,繁殖更快
動物的胃腸道棲息的細菌大約30個屬500多種,主要由厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成,其中專性厭氧菌占99%以上,專性厭氧菌,是腸道的優勢菌群,如雙歧桿菌、類桿菌、優桿菌和消化球菌等,其中芽孢桿菌就有千餘株。如何在如此眾多的菌群中篩選出有益於動物生長並易於體外培養的菌株是前期工作中的重點和難點。一株優良的生產用微生態菌株是經過繁雜的前期分離篩選和馴化過程的,其選育步驟如下:樣品採集、增殖培養、分離純化和性能測定。其中最重要的一步就是分離基質樣品的採集(即菌種的來源何處),如果採集到的基質不好,就無法分離出好性能的菌種。所以,如果我們要選育一株對動物腸道有益的菌株,最佳的方式就是分別從不同動物腸道中篩選出不同的菌種。
採集正常體徵表現的動物消化道食糜中,一般實驗室中以適當的選擇壓力對菌株其進行篩選如抗生素試驗、熱耐受試驗等極端條件,這就是對菌種的定向培育過程,從而使其通過馴化的過程強化菌株功能的過程。
芽孢菌類微生物飼料添加劑是以芽孢形式存在,其對動物能否發揮有益作用,主要取決於是否能在動物消化道快速萌發成具有代謝活性的營養細胞並快速生長繁殖。相比於普通枯草芽孢桿菌,菌株具有特異性更強、活力更高、繁殖更快的特點。其進入不同動物體後,能迅速適應不同的消化道環境,快速由芽孢狀態萌發為營養體,以二等分裂方式生長繁殖,腸精靈產品中枯草芽孢桿菌經同源篩分和合生髮酵技術後,繁殖一代僅需10-11min。這就是菌株同源性的優勢:菌種活力更強,繁殖更快。
為了實際生產的需要,益生菌株應有生長速度快、存活期長,易保存等特性。腸道中病原菌如變形桿菌、假單胞菌和產氣莢膜梭菌等,多為過路菌,長期定植的機會少。生態平衡時,這些菌數量少,不會致病,如果數量超出正常水平,則可引起機體發病。經過了同源篩分、定向選育後的菌種再次導入到動物體內時,菌種只要滿足以下兩個條件:1、食糜中水分不低於30%;2、飼料或食糜中應含有可溶性核酸、胺基酸和單糖,即可短時間內萌發,萌發率達到95%以上。實驗表明,動物體內芽孢桿菌的作用是機制是在動物消化道芽孢和營養體快速形態交替過程中,產生各種營養物質,並產生蛋白酶、澱粉酶和脂肪酶,促進動物的消化吸收,與病原菌競爭營養物質;提高機體的免疫機能,調節消化道健康,最終達到增強動物體的免疫功能的目的。所以,進入動物腸道後菌種是否有萌發,快速投入到動物自身的免疫系統作用中才是芽孢桿菌發揮作用的關鍵。
安全性
同源篩分菌種的安全性
根據動物的不同生長發育階段、健康狀況、環境和季節合理來選擇益生菌非常重要。但在益生菌的選擇過程中最重要的一點經常被所忽略--安全性。現在,益生菌的套用一般認為是安全的,但實驗中從宿主感染位點分離出來益生菌的現象,導致了益生菌轉移的假說:Rodriguez等在益生菌安全試驗中發現,當鼠李糖乳酸桿菌添加量為109cfu/天時,7天后在實驗小鼠的肝臟和脾臟中發現相應的細菌;當試驗小鼠的飼餵劑量為1011cfu/天時,2天后引發細菌的轉移。這種轉移在健康宿主身上很難發生,即使發生負面效果也很小,一但免疫系統受損後這種報告就相對較多。Adams(1999)綜述了可能由乳酸菌引起的機體感染症:心內膜炎、菌血症及其他的一些胸部和消化道感染。所以,每株菌都必須進行菌株特異性評定,必須從健康動物的體內分離;必須經過一定時間來證明其不產生任何內外毒素、無致病性;不攜帶可以轉移的耐藥基因,以確保菌株的對宿主健康作出的功效,實驗其安全性的驗證。
專性厭氧菌是腸道的優勢菌群,超過需氧菌102~104倍,主要以擬桿菌、真桿菌和雙歧桿菌以及厭氧的革蘭氏陽性球菌為主。這些腸道固有菌群在維持腸道功能方面具有舉足輕重的作用。一般認為每克中活菌(或孢子)數以105-106CFU/g為宜。大量科學試驗證實,當添加量低於105CFU/g時,由於攝入量太少,基本不能產生可以感知的性能改善;但當添加量大於107CFU/g時(不管是何種益生菌),會對腸道內原有菌群平衡產生較大影響,一般這種影響都是向著與動物自身健康相反的方向發展。腸道平衡打破後容易引起菌群失調,臨床上以腹瀉為最明顯症狀。其它的像由腸道菌群中潛在致病菌引起的內源性感染和一些過敏性疾病如特異性反應性濕疹,炎症性腸病等,一般認為與菌群變化導致腸道屏障功能的損害及免疫系統紊亂有關。當動物處於機能紊亂、亞健康或者疾病狀態時,將會消耗和浪費更多的營養物質。一旦感染壓力增加、動物處於亞健康狀態時,用於免疫的營養需要比例將會迅速提高到20-45%。以白羽肉雞為例,飼養周期為7周,發生消化道疾病後腹瀉通常需要一周才能康復,這就好像一個活70歲的人,其中有10年在拉肚子的嚴重情況一樣。