前言
本標準由中華人民共和國衛生部提出並歸口。
本標準起草單位:中國疾病預防控制中心營養與食品安全所。
本標準主要起草人:楊大進、魯傑。
範圍
本標準規定了保健食品中維生素B的測定方法。
本標準適用於片劑、膠囊、粉劑、功能性飲料類型保健食品中維生素B的測定。
本方法使用固相萃取法處理樣品時，取樣量為2.0g，方法的檢出限為1.0μg/g。當套用免疫親和法處理樣品時，片劑、膠囊、粉劑取樣量為2.0g，方法的檢出限為0.055μg/g；功能性飲料取樣量為20 mL，方法的檢出限為3.0 μg/L。
原理
採用固相萃取法或免疫親和色譜法對試樣提取液中的維生素B進行富集並去除部分雜質，高效液色譜分析。
試劑
除非另有規定，本標準中所用試劑均為分析純。實驗用水均為實驗室一級用水，電導率(25℃)為0. 01 mS/m。
乙睛(CHN):色譜純。
甲醇(CHO):優級純。
乙醇(CHO)。
四丁基氯化銨(CHNCl) 。
5%四丁基氯化銨(CHNCl)溶液:稱取5. 0g四丁基氯化銨，加水溶解並稀釋至100 mL 。
三氯甲烷(CHCl) 。
三氟乙酸(CFOH) 。
檸檬酸(CHO)。
磷酸二氫鉀(KHPO)。
氫氧化鈉（NaOH)。
磷酸緩衝液(pH6.5):取磷酸二氫鉀0.68 g，加0. 1 mol/L氫氧化鈉溶液15. 2 mL，再用水稀釋至100 mL。
維生素B標準品:純度≥99%。
5%乙睛:量取50mL乙睛，用水稀釋定容至1000 mL。
25%乙睛:量取250 mL乙睛，用水稀釋定容至1000 mL 。
維生素B標準儲備液:稱取維生素B標準品10mg(精確至0.1mg)，用5%乙醇溶解，並定容至10 mL棕色容量瓶中，混勻，得到維生素B的標準儲備液。冷藏保存。
維生素B標準中間液:吸取1mL儲備液至25mL棕色容量瓶中，用水稀釋得到維生素B的標準中間液。冷藏保存。
維生素B標準系列:分別吸取0.05 mL,0.10 mL,0.50 mL，1.00 mL,2.00 mL,5.00 mL的標準中間液於10 mL棕色容量瓶中，用水稀釋得到維生素B標準溶液系列。
儀器和設備
高效液相色譜儀，附紫外檢測器。
超音波清洗器。
離心機:4 000 r/min。
固相萃取柱:N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯親水親脂平衡型固相萃取柱(60mg, 3 mL)。
免疫親和淨化柱:維生素B免疫親和淨化柱(EASI-EXTRACT. VITAMINE B)。
固相萃取法(前處理方法一)操作步驟
試樣處理
將20粒片劑、膠囊試樣粉碎或混勻;粉劑試樣取5包~10包充分棍勻。
提取
稱取試樣4 g ~10 g(相當於含維生素B 4 μg左右，精確至0. 001 g)於50 mL離心管中，加10 mL~15 mL水，混勻，將其置於超音波清洗器中，超聲提取約10 min後以4 000 r/min離心5 min。用吸管吸取上清液置於另一個50 mL離心管中。對殘渣按上述步驟每次加人約10 mL水，重複提取兩次，合併提取液於50 mL離心管中。
淨化
向提取液中加人5%四丁基氯化銨溶液1 mL、三氯甲烷約20 mL，使用渦旋混勻器充分混勻，於離心機中以1 000 r/min離心3 min。將水層轉入蒸發皿中，置水浴鍋上加熱蒸發至乾。殘渣用乙醇溶解，轉移至離心管中，超聲溶解，離心，吸取上清液於蒸發皿中。再重複提取兩次，合併提取液於蒸發皿中。蒸乾乙醇，試樣用5mL5%乙睛溶液定量轉移到試管中，待上固相萃取柱。
固相萃取
固相萃取柱先用3 mL甲醇進行活化，再用3 mL水對固相萃取柱進行平衡，速度為1滴/s。將上述處理過的適量試樣加到固相萃取柱上。上樣後，用5 mL 5%乙睛溶液作為洗脫溶劑將干擾物質從固相萃取柱上淋洗下來，最後用25%乙睛溶液將維生素B洗脫下來，收集洗脫液0.5 mL。
免疫親和法(前處理方法二)操作步驟
試樣處理
碳酸型功能性飲料:取150 mL樣液於超音波中脫氣10 min，待用。
果粒或果汁型功能性飲料:用1 mol/L氫氧化鈉調pH至7. 0，置離心機中以轉速4 000 r/min離心10 min，過濾，濾液待用。
片劑、膠囊、粉劑:取20粒片劑、膠囊試樣粉碎或混勻。粉劑試樣取5包~10包充分混勻。
稱取試樣10 g~50 g(相當於維生素B的量為25μg~2 500 μg，精確至0. 001 g)於250 mL容量瓶中，加人100 mL水，振搖混勻，將其置於超音波清洗器中，超聲提取約15 min後用水定容，稀釋樣品溶液的濃度到樣品中維生素B的含量為25μg/mL。如樣品溶液的pH在7. 0以上，用檸檬酸調節pH在4. 5 ~7. 0之間;如樣品溶液的pH在4. 5以下，則套用磷酸緩衝液代替水作為提取液並重複上面步驟。
富集、淨化
維生素B免疫親和淨化柱先用10 mL水淋洗小柱中未鍵合的化合物，吸取24 mL提取液上樣到淨化柱上，再用3 mL甲醇洗脫維生素B至蒸發皿中，整個過程速度約為1滴/S。於60℃~70℃水浴中蒸乾溶劑，用1 mL 0. 025%的三氟乙酸溶液溶解，溶液過0.45μg水系濾膜，待高效液相色譜用。
液相色譜參考分析條件
色譜柱:C18 (4.6 mm X 250 mm, 5μm)反相色譜柱。
流動相:採用梯度洗脫方式，見表1。
| t/min | A; 0. 025%三氟乙酸〔pH=2. 6) | B:乙睛 |
| 0 ~3. 5 | 100 | 0 |
| 3. 5~11 | 75 | 25 |
| 11~19 | 65 | 35 |
| 19~20 | 90 | 10 |
| 20~30 | 100 | 0 |
流速:1 mL/min 。
檢測波長:361nm。
柱溫:室溫。
測定
吸取20 μL標準溶液和試樣溶液注人高效液相色譜儀中，以保留時間定性，用標準曲線法進行測定。
結果計算
按式(1)計算試樣中維生素B12的含量。
保健食品中維生素B12的測定…..........…(1)
式中:
X—試樣中維生素B的含量，單位為微克每克或微克每毫升(μg/g或μg/mL) ;
A—從標準曲線上查得的含量，單位為微克(μg) ;
f—試樣稀釋倍數;
m—試樣的取樣量，單位為克或毫升(g或mL) 。
計算結果保留兩位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。
色譜圖
維生素B標準色譜圖見圖1。
保健食品中維生素B12的測定