前言
本標準由中華人民共和國衛生部提出並歸口。
本標準負責起草單位:中國疾病預防控制中心營養與食品安全所。
本標準參加起草單位:河北省疾病預防控制中心、吉林省疾病預防控制中心。
本標準主要起草人:楊大進、方從容、王竹天、韓會新、李青。
本標準為首次發布。
範圍
本標準規定了保健食品中綠原酸的測定方法。
本標準適用於以金銀花、菊花、杜仲、山植等一種或幾種為主要原料的保健食品中綠原酸的測定。
當取樣量為2.0 g時，定容體積為25 mL時，方法的檢出限(LOD)為1. 4 X 10-2 g/kg，方法的定量限(LOQ)為 4.0 X 10-3 g/kg。方法的線性範圍為2.0μg/mL~80 μg/mL。
原理
根據綠原酸易溶於甲醇、乙醇等極性有機溶劑的理化特性，一般試樣中的綠原酸用70%甲醇提取，如果試樣為油性軟膠囊，可用石油醚脫脂揮乾後再用70%甲醇提取。提取液定容，過濾後進高效液相色譜儀，經反相色譜分離後，由紫外檢測器檢測，根據保留時間和峰面積進行定性和定量。
試劑和材料
乙酸(CHCOOH):優級純。
乙睛（CHCN):色譜純。
甲醇(CHOH):色譜純。
石油醚:分析純，沸程30℃~60℃。
水(HO):為實驗室一級用水，電導率(25℃)為0. 01 mS/m,
綠原酸標準品:純度≥99%。
綠原酸標準儲備液((2.00 mg/mL):稱取綠原酸標準品0.02 g(精確至0.000 1 g)於10.0 mL容量瓶中，加流動相溶解並定容至刻度，混勻(此標準儲備液在4℃冰櫃中，可保存5 d) 。
綠原酸標準使用液(200 μg/mL):準確量取1. 00 mL綠原酸標準儲備液於10. 0 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混勻(此標準使用液在4℃冰櫃中，可保存5 d) 。
1.乙酸(CHCOOH):優級純。
2.乙睛（CHCN):色譜純。
3.甲醇(CHOH):色譜純。
4.石油醚:分析純，沸程30℃~60℃。
5.水(HO):為實驗室一級用水，電導率(25℃)為0. 01 mS/m,
6.綠原酸標準品:純度≥99%。
7.綠原酸標準儲備液((2.00 mg/mL):稱取綠原酸標準品0.02 g(精確至0.000 1 g)於10.0 mL容量瓶中，加流動相溶解並定容至刻度，混勻(此標準儲備液在4℃冰櫃中，可保存5 d) 。
8.綠原酸標準使用液(200 μg/mL):準確量取1. 00 mL綠原酸標準儲備液於10. 0 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混勻(此標準使用液在4℃冰櫃中，可保存5 d) 。
儀器和設備
高效液相色譜儀:附紫外檢測器。
超音波清洗器。
離心機:4 000 r/min。
1.高效液相色譜儀:附紫外檢測器。
2.超音波清洗器。
3.離心機:4 000 r/min。
分析步驟
試樣處理
一般試樣:稱取0.5 g~2 g粉碎均勻的試樣(精確到0.001 g)於25. 0 mL容量瓶中，加人20 mL70%甲醇，超音波提取30 min，用70%甲醇定容至刻度，混勻(如試樣中綠原酸含量較高，可適當進行稀釋)，過0.45μm濾膜，濾液供液相色譜分析。
油性試樣:稱取0. 5 g~2 g均勻的試樣(精確到0.001 g)於25 mL離心試管中，加入15 mL石油醚，振搖1 min後，以3 000 r/min離心10 min，棄去溶劑後再重複一次。將試樣中溶劑揮乾後加人70%甲醇，其餘步驟同上。
液體試樣:以3 000 r/min離心10 min後(如試樣中綠原酸含量較高，可適當進行稀釋)，過0.45μm濾膜，濾液供液相色譜分析。
標準曲線的製備
分別吸取綠原酸標準使用液，用流動相稀釋並在容量瓶中定容的濃度分別為2.00，10.0，20.0，40.0，80.0 μg/mL標準系列。
液相色譜參考條件
色譜柱:ODS C色譜柱，250 mmX4. 6 mm,5 μm。
流動相:0. 5%乙酸溶液十乙睛=9+1。
流速:1.0 mL/mim,
柱溫:35 ℃。
檢測波長:327 nm。
進樣量:10 μL 。
色譜分析:取標準溶液和試樣溶液注入色譜柱中，以保留時間定性，以試樣峰面積或峰高與標準比較定量。
1.色譜柱:ODS C色譜柱，250 mmX4. 6 mm,5 μm。
2.流動相:0. 5%乙酸溶液十乙睛=9+1。
3.流速:1.0 mL/mim,
4.柱溫:35 ℃。
5.檢測波長:327 nm。
6.進樣量:10 μL 。
7.色譜分析:取標準溶液和試樣溶液注入色譜柱中，以保留時間定性，以試樣峰面積或峰高與標準比較定量。
結果計算
試樣中綠原酸的含量按式(1)進行計算:
保健食品中綠原酸的測定…....…(1)
式中:
X—試樣中的含量，單位為克每千克或克每升(g/kg或g/L)；
c—由標準曲線求得進樣液中綠原酸的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL) ;
V—試樣定容體積，單位為毫升(mL) ;
m—試樣質量或體積，單位為克或毫升(g或mL) 。
計算結果保留三位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
色譜圖
在上述色譜條件下的色譜圖見圖1~圖2。
圖1 綠原酸標準色譜圖
圖2 綠原酸試樣色譜圖