串聯親和純化

串聯親和純化（TAP/MS）是免疫共沉澱（Co-IP/MS）的“近親”，兩者在尋找誘餌蛋白的互作蛋白以及純化互作蛋白的原理方面非常相似。但是TAP/MS經過2步親和純化，而Co-IP/MS只有1步親和純化，故而TAP/MS可以有效減少非特異蛋白的結合 。 基本流程：構建含有目的基因的載體，使目的基因與2個不同的表位標籤融合表達，如Flag、HA、His、CBP、SBP等等。採用Flag-HA雙標籤載體；載體轉染細胞並表達融合蛋白“Flag-HA-誘餌蛋白”；細胞裂解提取總蛋白，經anti-flag樹脂和anti-HA樹脂的兩步純化和洗脫，更大限度了去除了假陽性蛋白。洗脫液進入質譜儀，分析鑑定與誘餌蛋白具有相互作用的蛋白 。

技術優勢

1、 TAP/MS得到的互作蛋白是在細胞內與誘餌蛋白結合的，符合體內真實生理情況，得到的結果可信度高。

2、 採用兩步純化，可以有效的減少非特異蛋白的結合，並避免因過度沖洗而產生的複合體解離 。

技術路線

串聯親和純化

操作 。

實驗步驟

1、 構建融合Flag-HA的誘餌蛋白真核表達載體或者慢病毒載體

2、 載體瞬時轉染靶細胞或包裝慢病毒感染靶細胞

3、 TAP純化互作蛋白

4、 質譜鑑定互作蛋白 。