RKIP

RKIP，定位於染色體12q24.23，其mRNA長1507bp，由4個外顯子轉錄產生。

1 RKIP蛋白基因表達與其功能
人RKIP基因定位於染色體12q24.23，其mRNA長1507bp，由4個外顯子轉錄產生。免疫組織化學分析顯示，在許多組織中RKIP主要定位於細胞質及質膜上[[3]]。人的RKIP在多種組織和不同類型細胞都有表達，如腦膠質細胞，浦肯野細胞以及腦皮層和腦海馬層；生殖系統的精子細胞、睪丸上皮細胞、附睪上皮細胞、前列腺、輸卵管、卵巢、子宮，胰島B細胞和胰島多肽分泌細胞等[[4]]。磷酸化的RKIP結合中期染色體的中心體以及著絲點區域，從而可能參與調節染色體的分割和有絲分裂的進行。RKIP的丟失破壞了細胞穩態，導致腫瘤等疾病的發生[[5]]。Fu等人研究表明RKIP可以作為前列腺癌轉移的標誌物，這體現了RKIP在實際臨床中的作用[[6]]。天津醫科大學的Li HZ等人研究表明RKIP是人上皮細胞卵巢癌的轉移抑制基因[[7]]。RKIP的功能下降可能影響腫瘤轉移、血管發生、抗凋亡能力以及染色體的完整性。RKIP的衰退可能同樣影響心臟、神經系統的功能，影響精子發生、生殖行為等。
2 RKIP與傳導通路
2.1 RKIP與Raf-1/mek/ERK信號轉導通路
在Raf-1/MEK/ERK信號傳導通路中，有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase ,MAPK)和細胞外信號調節激酶（extracellular-signal regulated kinase ,ERK）最初是同一激酶，後來隨著這類激酶數量猛增，MAPK通指所有這類激酶，ERK特製p44和p22這一亞家族。激活MAPK的激酶是MEK，MAPK被激活後能刺激AP1等轉錄因子產生生物學作用。這條通路對細胞增殖、分化、凋亡、和遷移都有重要作用[[8]]，它的調節失常可能與人類包括癌症在內的很多疾病的發生髮展都有關係[[9]]。在尋找Raf-1的調控蛋白過程中，Yeung等[[10]]報導，RKIP能結合Raf-1，並且干擾下游的MAPK通路。他進一步研究證明過表達RKIP可以競爭性抑制Raf-1的下游靶點MEK。學術界的爭論不可避免，Trakul等人發現RKIP可以抑制Raf-1的活性，但是RKIP基因敲除後，Raf-1信號途徑並沒有明顯的激活作用[[11]]。他指出內源RKIP是通過選擇性調控Raf-1的激活，而不是破壞MEK和Raf-1的相互作用來抑制MAPK通路。當Raf-1富集到質膜後，RKIP與其結合，阻止Raf-l與PAK(p21-activated kinase)結合，從而阻斷PAK和絲氨酸蛋白酶對Raf-l的磷酸化。Houben進一步的研究表明RKIP在麥可細胞癌對MAPK激酶傳導途徑中不能起到關鍵作用，而且RKIP的缺失也不能挽救ERK信號傳導的缺失，他認為RKIP在MAPK的傳導通路上起到調節器而不是抑制器的作用[[12]]。RKIP被PKC介導磷酸化後同Raf-1的結合明顯下降，但是用其它胺基酸（Glu）替代磷酸位點(Ser-153)並不能使RKIP和Raf-1的結合下降，這說明是磷酸基的立體結構阻礙了它們的結合，不是負離子發揮的作用[[13]]。此外，PKC可以直接調節Raf，其機制是和RKIP途徑不同的。以上發現說明了RKIP調節Raf的機制要比預計的複雜的多，有待科學家更加深入的研究。
2.2 RKIP與G蛋白偶聯受體信號轉導通路
G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptors，GPCR)有800多個成員，組成了細胞膜最大的受體家族，這些受體控制了很多基本的生理過程，比如神經傳遞，激素、酶的釋放，炎症和血壓調節等等[[14]]。GRK-2(G protein-coupled receptor kinase-2)是G蛋白偶聯受體的負反饋抑制因子[[15]]。GRK-2磷酸化GPCR後，使之與活性的G蛋白脫離並開始內化，從而使G蛋白信號失活。Lorenz等[[16]]證實RKIP是GRK-2的生理性抑制因子，它能夠與GRK-2的氨基末端結合，從而抑制後者對GPCR的磷酸化。PKC對RKIP(Ser-153)的磷酸化使RKIP與Raf-1脫離，並轉而與GRK-2結合，抑制GRK-2的活性最終增強了G蛋白偶聯受體信號，因此RKIP對G蛋白偶聯受體信號轉導通路具有正向調節作用。在RKIP基因敲除的心肌細胞中，b腎上腺素受體刺激的cAMP水平和收縮能力都降低，使RKIP的這種調節信號傳導的途徑得到了生理實驗的證明。
2.3 RKIP與NF-kB信號
除對Raf-1/MEK/ERK和G蛋白偶聯受體信號通路的調控外，RKIP還參與了對NF-kB信號通路的調控[[17]]，並且這種調節作用不依賴於MAPK信號傳導級聯繫統。轉錄因子NF-kB家族可以通過協調眾多基因的表達，控制免疫、應激等反應。抑制RKIP能增強NF-kB的轉錄，而過表達RKIP能減少NF-kB基底水平的轉錄[[18]]。RKIP可以抵抗NF-kB對TNF-α和IL-1β刺激的反應，RKIP還影響到了NF-kB的上游，抑制諸如NIK,TAK1，IKKα/β等多種激酶。這種實驗結果是在體外通過超量表達RKIP水平得到的結論，只有在基因敲除實驗和體內實驗的結果出來後才能讓我們更加確切的了解RKIP在NF-kB信號傳導中的作用。
綜上所述，RKIP在Raf-1/MEK/ERK、G蛋白偶聯受體和NF-kB信號通路中發揮關鍵的調控作用，而這些信號通路在細胞生長、增殖、分化和腫瘤發生等多個過程中都發揮重要的調節作用。我們已經明確RKIP在許多不同細胞類型中都有表達，並且表達的量也有很大的不同，除Raf-1、GRK-2和NF-kB上游激酶(NIK、TAK1、IKKa和IKKb)已被證實為RKIP作用的靶標外，很有可能還存在其他的RKIP作用靶物對其他信號通路產生影響，這還有待於進一步探討。（圖1）
圖1 RKIP 調控的信號途徑
3 RKIP與凋亡
3.1 細胞凋亡簡單介紹
凋亡又被稱為細胞程式化死亡，包括腫瘤細胞在內的大多數細胞都存在受到一定的刺激而引起死亡的現象。凋亡激活失控可以導致一系列的疾病包括癌症以及自身免疫病等[[19]]。細胞凋亡涉及了細胞支架破壞，細胞固縮，細胞核和染色體DNA濃縮和斷裂細胞膜起泡，核酸內切酶的激活，膜性凋亡體的形成等等。調節和執行凋亡細胞死亡是由一個半胱氨酸蛋白酶的家族完成的，它們有門冬氨酸的種屬特異性，被稱作caspases。目前已知道三個主要的細胞凋亡路徑：一是死亡受體信號途徑，涉及到了腫瘤壞死因子（TNF-a），TNF相關性凋亡介導配體（TRAIL）,Fas配體（FasL）[[20]]，當死亡的配體結合到它們同族受體上，從而引起的凋亡；另一種凋亡途徑涉及到了線粒體內膜的損壞和caspses-9的激活；還有一種是通過內質網信號傳導通路，包括非摺疊蛋白反應和鈣離子起始信號等機制, 內質網應激可特異性激活caspase級聯最終導致細胞凋亡。事實上，目前大多數化療藥物都是通過誘導細胞凋亡清除腫瘤細胞的[[21]]，細胞凋亡路徑的破壞導致了耐藥的產生。
儘管先前的研究表明了RKIP調控ERK和NF-kB信號傳導途徑，但是目前RKIP究竟怎樣調控抑制凋亡的刺激尚為明確。通過RKIP可以抑制性調控ERK和NF-kb的途徑，很可能這些途徑改變的基因產物控制著細胞的存活，保護細胞免遭凋亡。這兩個途徑和它們相關的轉錄因子（NF-kb和AP-1）調節了一些與凋亡有關的蛋白如Bcl-2，Mcl-1，TNK-a和IKBa[[22]]等，正因為有這些關聯，我們可以推測改變凋亡相關基因產物的表達是增加RKIP提高凋亡敏感性的直接原因。Zuo H Y等人研究表明在電磁誘導海馬神經元死亡和凋亡過程中，過度激活的RKIP調控的ERK通路起了重要作用[[23]]。在前列腺細胞和黑色素瘤細胞超量表達RKIP可以抑制NF-kb並上調TRAIL受體DR5（death recepter 5），使TNF關聯的凋亡敏感，導致TRAIL介導的細胞凋亡。
圖2 RKIP促進藥物介導細胞凋亡途徑
3.2 RKIP抑制NF-kB調控凋亡
NF-kB是rel轉錄因子家族的成員，參與介導了許多生物學活動，比如炎症、免疫反應、細胞增殖以及細胞凋亡等等。NF-kB通常在細胞漿中和它的抑制因子IkB結合，IkB通過非共價鍵結合併掩蓋了NF-kB的核定位信號區，達到阻止NF-kb核轉錄的作用。IkB被IKK複合體磷酸化、泛素化後，在蛋白酶體降解，隨後NF-kb易位到細胞核。它參與了眾多基因的轉錄子調節並且產生種種生物學活性[[24]]。這些基因被NF-kB和其他的炎性因子(IL-1, IL-6, IL-8, 和 TNF-a)，抗凋亡因子c-IAPs(c-IAP-1和-2)，Bcl-2家族成員(Bcl-2, Bcl-xL,和 Mcl-1以及負性調控NF-kB的物質調控。因此，NF-kB可以調控促凋亡和抗凋亡基因(如Bcl-xL和Bcl-2)的表達，依靠刺激和細胞類型的不同產生不同的生物學結果，Jazirehi等人發現在霍奇金細胞系中用利妥昔單抗上調RKIP的表達可以抑制NF-kB途徑22（圖2），降低抗凋亡基因的表達，改變了抗凋亡和促凋亡信號通路的平衡。因此，藥物抵抗的淋巴瘤B細胞系變得對藥物介導的凋亡敏感。令人意外的是在非腫瘤細胞觀察不到RKIP調控NF-kB以及對死亡配體的敏感，但是PEBP另一個家族成員hPEBP4同樣抑制Raf-1/MAPK途徑卻可以阻滯凋亡[[25]]。
3.3 RKIP抑制AP-1表達調控細胞凋亡
激活蛋白-1（activating protein-1，AP-1）轉錄因子參與了細胞存活和凋亡途徑。一些AP-1蛋白如c-jun在一系列激刺激下被早期激活的基因編碼，另一些在翻譯後加工來增加轉錄的活性[[26]]。研究表明這種蛋白家族扮演了各種不同的角色，例如c-jun在紫外線誘導凋亡中的反應[[27]]，還有研究表明c-jun在保護紫外線誘導細胞死亡的作用。兩種模式可以表明AP-1如何參與影響細胞生存和死亡。第一是AP-1誘導可以導致不同的基因比如FasL和Bim的轉錄，這些產物可以決定一個細胞是存活還是凋亡。第二種模式推測AP-1做為一個內環境穩定調節因子，維持細胞在一個有限增殖的狀態。環境因素可以改變AP-1的活性，改變存活基因和凋亡基因與它的平衡，這樣AP-1的活性就決定了細胞的存活還是凋亡。根據報導RKIP可以抑制Raf-1/MEK/ERK通路調節的AP-1的活性1，因此可以推測通過RKIP抑制AP-1的活性會導致抗凋亡蛋白表達的改變，減弱了這些蛋白抗凋亡的活性，這樣細胞就會對外界刺激凋亡信號更加敏感。在Jazirehi等人的利妥昔單抗研究中，發現利妥昔單抗在治療霍奇金淋巴瘤中引起Raf-1/MEK/ERK通路的抑制和下游活性AP-1結合DNA的抑制（圖2），AP-1的抑制導致了Bcl-xL轉錄的抑制，使細胞對藥物介導的凋亡敏感。很大程度上Raf-1/MEK/ERK通路的抑制與利妥昔單抗誘導RKIP的表達有關。
很明顯，RKIP抑制NF-kB和ERK通路或者是它抑制兩個通路中的任意一個可能足以引起凋亡信號的執行。這意味著在RKIP介導下ERK和NF-kB通路抑制，NF-kB和AP-1的局部轉錄子活性破壞可能放大凋亡信號。雖然利妥昔單抗介導了RKIP表達和ERK的抑制，但是單獨在淋巴瘤細胞套用利妥昔單抗不能檢測到明顯的凋亡。然而，這些細胞表現出可以提高化療介導凋亡的敏感性。在前列腺癌細胞系用RKIP轉染後同樣可以觀察到提高藥物抵抗細胞株化療敏感性的作用[[28]]。值得注意的是，過量表達在藥物敏感和藥物抵抗細胞株RKIP可以在沒有藥物的情況下引起凋亡。因此，RKIP介導的生物學結果可能因細胞種類而不同，或者細胞分化階段不同，細胞內的信號分子激活狀態不同有所變化的。
3.4 RKIP通過GRK-2在凋亡中的起到的調控作用
RKIP的ser-153被PKC磷酸化後，阻斷GRK-2的活性。而GRK-2對GPCRs的起負反饋調節的作用，這樣RKIP就可以通過GRK-2影響了細胞信號的調控，它和GPCRs存在正反饋關係。GPCRs的激活導致了RKIP同Raf-1的分離。癌細胞缺乏GPCRs激活的情況下，RKIP可能聯合Raf-1和IKK調節存活通路，這也於RKIP表達的水平有關。腫瘤細胞無疑會選擇低表達RKIP的水平來維持細胞存活，誘導RKIP的表達會改變細胞死亡途徑的平衡。然而，有活性的腫瘤細胞可以對GPCRs的激活做出反應，利用RKIP來維持細胞的激活和刺激，提高藥物誘導凋亡的閾值。從這裡可以看出，人為改變RKIP的水平可以對腫瘤細胞產生破壞作用。
4 結論
分子靶向治療逐漸成為現代腫瘤學的一個突出的特徵，引起癌症細胞程式化死亡（凋亡）就是一個最終的目的。因此，引起凋亡的分子機制的決定了治療的有效性以及藥物的組成。RKIP同細胞特別是腫瘤細胞的凋亡存在密切關係，提高RKIP的表達和藥物調控凋亡存在正相關性，揭示了提高RKIP的表達能使藥物直接介導凋亡或間接提高腫瘤細胞對化療的敏感性。並且RKIP在信號傳導上存在不同途徑（Raf-1/MEK/ERK, IKK/IKB/NF-kB, GRK-2)，這些通路可能就是潛在的治療靶點。今後描繪出RKIP轉錄水平的調節，鑑定出可以控制或（和）抑制RKIP表達的物質是就是我們的工作。RKIP作為轉移抑制基因有很大的臨床意義，這不只是讓我們找到了早期診斷的標記物，更是因為它為腫瘤轉移找到了治療干預新的靶點。更深入的了解RKIP如何在腫瘤細胞調控表達，它如何直接的影響了凋亡和信號傳導等等，將為提高治療腫瘤水平發揮理想的作用。
參考文獻
[[1]] Yeung K, Seitz T, Li S, et al. Suppression of Raf-1 kinase activity and MAP kinase signaling by RKIP[J]. Nature, 1999, 401, 173–177.
[[2]] Hickox DM，Gibbs G，Morrison JR，et al．Identification of a novel testis-specific member of the phosphatidylethanolamine binding protein family，pebp-2[J].Biol Reprod, 2002,67(3):917-927.
[[3]] ValleeB S，TaucP，BrochonJC，et a1．Behaviourofbovine phosphatidylethanolamine-binding protein with model membranes．Evidence of affinity for negatively charged membranes[J]．Ear J Biochem, 2001, 268(22):5831-5841.
[[4]] Zhang L,Fu Z,Biochem C, el al. Raf kinase inhibitory protein inhibits beta-cell proliferation[J].Surgery, 2004,136(3):708-715.
[[5]] Marsha Rich Rosner. MAP kinase meets mitosis: A role for Raf Kinase Inhibitory Protein in spindle checkpoint regulation [J]. Cell Division, 2007, 2:1.
[[6]] Fu Z, Kitagawa Y, Shen R, et al. metastasis suppressor gene Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a novel prognostic marker in prostate cancer[J]. Prostate, 2006, 66(3):248-256.
[[7]] Li HZ, Wang Y, Gao Y, et al.Effects of raf kinase inhibitor protein expression on metastasis and progression of human epithelial ovarian cancer. [J] Mol Cancer Res, 2008, 6(6):917-928.
[[8]] Pearson G, Robinson F, Beers Gibson T, et al. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions [J]. Endocr Rev, 2001, 22 (2): 153-183.
[[9]] Schubbert S, Shannon K, Bollag G. hyperactive Ras in developmental disorders and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(4): 295-308.
[[10]] Yeung K，Janosch P，McFerran B，et a1．Mechanism of suppression of the Raf/MEK/extracellular signal-regulated kinase pathway by the Raf kinase inhibitor protein[J]．Mol Cell Biol, 2000,20(9)：3079-3085.
[[11]] Trakul N，Rosner M R．Modulation of the MAP kinase signaling cascade by Raf kinase inhibitory protein [J].Cell Res.2005, 15(1):19-23.
[[12]] Houben R, Ortmann S, Becker JC. RKIP does not contribute to MAP kinase pathway silencing in the Markel Cell Carcinoma cell line UISO [J]. J Carcinog, 2007, 6:16.
[[13]] Corbit KC, Trakul N, Eves EM, et al. Activation of Raf-1 signaling by protein kinase C through a mechanism involving Raf kinase inhibitory protein [J]. J Biol Chem .2003, 278 (15): 13061-13068.
[[14]] Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. Seven-transmembrane receptors [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3(9):639-650.
[[15]] Kroslak T，Koch T，kaba E，et al．Human phosphatidylethanolamine binding protein facilitates heterotrimeric G protein-dependent signaling [J].J Biol Chem, 2001, 276(43):39772-39778.
[[16]] Lorenz K，Lohse M J，Quitterer U．Protein kinase C switches the Raf kinase inhibitor from Raf-1 to GRK-2[J].Nature, 2003, 426(6966):574-579.
[[17]] Keller E T，Fu Z，Brennan M．The biology of a prostate cancer metastasis suppressor protein：Raf kinase inhibitor protein[J]．J Cell Bichem, 2005,94(2)：273-278.
[[18]] Yeung KC, Rose DW, Dhillon AS, et al. Raf kinase inhibitor protein interacts with NF-κB-inducing kinase and TAK1 and inhibits NF-κB activation[J]. Mol Cell Biol .2001, 21(21): 7207 -7217.
[[19]] solary E, DUBREZ l, EVMIN b.The role of apoptosis in the pathogenesis and treatment of diseases [J]. Eur Respir J, 1996, 9(6):1293-1305.
[[20]] Shresta S, Pham c t, Thomas d a, et al. How do cytotoxic lymphocytes kill their targets? [J]. Curr Opin Immunol, 1998, 10(5):581–587.
[[21]] 曾益新，主編。腫瘤學，第2版 [M] 北京：人民衛生出版社.2004,228.
[[22]] Jazirehi Ar,vega mi , Chatterjee D，et al. Inhibition of the Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway, Bcl-xL down-regulation, and chemosensitization of non-Hodgkin's lymphoma B cells by Rituximab[J]. Cancer Res, 2004, 64(19): 7117-7126.
[[23]] Zuo HY，Wang DM，Peng RY，et al. The role of RKIP mediated ERK pathway in hippocampus neurons injured by electromagnetic radiation [J]. Chinese journal of cellular and molecular immunology, 2008, 24(7):660-662.
[[24]] Karin M, Cao Y, Greten FR,et al. NF-kB in cancer: From innocent bystander to major culprit[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(4): 301-310.
[[25]] Li H, Wang X, Li N,et al. hPEBP4 resists TRAIL-induced Apoptosis of human prostate cancer cells by activating Akt and deactivating ERK1/2 pathways[J]. J Biol Chem, 2007, 282(7):4943-4950.
[[26]] Ventura J, Kennedy NJ, Lamb JA, et al. C-Jun NH2-terminal kinase is essential for the regulation of AP-1 by tumor necrosis factor [J]. Mol Cell, 2003, 23, 2871–2882.
[[27]] Shaulian E，Karin M. AP-1 as a regulator of cell life and death [J]. Nat Cell Biol, 2002, 4(5): 131–136.
[[28]] Chatterjee D,bai yin,wang zhe, et al, RKIP sensitizes prostate and breast cancer cells to drug-induced Apoptosis [J]. J Biol chem, 2004, 279(17):17515–17523.