原理
Southern印跡法(Southern Blot)是將基因組 DNA經限制性內切酶酶解、瓊脂糖凝膠電泳分離,使DNA片段按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。經鹼處理凝膠使DNA變性(使雙鏈DNA變成單鏈)，通過具有一定鹽離子濃度溶液的虹吸作用，將凝膠中變性的單鏈DNA片段原位地吸印到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，經過乾燥或紫外線照射處理。單鏈DNA片段的極性基團與支持膜上的基團結合而使DNA分子牢固地固定到轉移膜上，轉移後的單鏈DNA分子與32P或35S標記的DNA探針按互補原理進行雜交。經放射自顯影對特定位置上顯現的特異DNA片段進行分析。這種方法最初是由Southern於1975年建立的。方法中DNA轉移的方式和複印的過程一樣，比較準確地保持了特異DNA順序在電泳圖譜中的位置，也可將變性的凝膠負壓乾燥後與特定的DNA探針進行原位雜交。它把電泳分離和雜交結合起來，不但能檢測出特異的DNA序列片段,而且能進行定位和測定分子量。即先以電泳後照相記錄的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ 或EcoRⅠ 降解的λDNA)為標準，精確測量各標準片段與電泳原點之間的距離。以DNA的Log10kb為縱坐標，移動距離(cm)為橫坐標，連線各已知條帶相應的點，得到一條標準曲線。然後測量未知條帶(放射自顯影后獲得的特異片段)的移動動距離,在標準曲線上找出相應的Log10kb值，以此計算出其分子量大小。器材
1電熱真空乾燥箱 2硝酸纖維素濾膜或尼龍膜 3大方瓷盤、帶蓋方盤、玻璃板 4濾紙、吸水紙、保鮮膜、蠟膜Parafilm、一次性手套等 5刀片、刻度吸管、鑷子、剪刀、lkg重物 二、材料 電泳分離DNA的瓊脂糖凝膠試劑
1 酸變性液:0.25mol/L HCl， 用分析純的鹽酸12Mol/L稀釋2鹼變性液,0.5mol/L NaOH，1.5mol/l NaCl pH13.1 3中和液，0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl 4 20×SSC: 0.3mol/檸檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方見附錄) 5 10×SSC和2×SSC用雙蒸餾水稀釋20×SSC儲存液實驗步驟
注意
注意，操作戴手套。凝膠處理
1)凝膠照相後切去包括標記帶在內的多餘部分。將凝膠的一角(·點第一個樣品的一側)切去作為標記 以便於定位。精確測量凝膠大小然後將凝膠放入一個方形瓷盤中 。2)變性：將凝膠浸泡於適量的鹼變性液中，室溫下變性30分鐘。期間更換變性液一次，不斷地輕輕搖動。如果先進行酸變性酸變性，則凝膠中溴酚蘭的顏色由黃變蘭對於較大的DNA片段(·如大於15kb)凝膠可在鹼變性前用0.25mol/L HCl預處理10分鐘使DNA片段脫嘌呤。凝膠中溴酚蘭的顏色由蘭變黃後再進行鹼變性。
3)中和:移去瓷盤中的鹼變性溶液,用雙蒸餾水漂洗凝膠兩次,然後浸泡於適量的中和液中,室溫下輕輕搖動15分鐘,更換新鮮中和液,再中和15分鐘。
膜處理
1)剪下一張與凝膠面積相同的硝酸纖維素膜(NCP)或尼龍膜,NL,。注意NCP也要剪去一角且不可用手觸摸,粘有油膩的膜不能被濕潤,也不能結合DNA。同時剪8,10張與NCP等大的乾淨濾紙2)將NCP與3,4張濾紙依次漂浮於盛有雙蒸餾水的帶蓋方盤中,使水自然從NCP的下面向上浸潤,待其完全浸濕後,連同浸濕的濾紙一起浸入於轉移液中浸泡5,10分鐘。· 注意,在蒸餾水中如NCP表面有氣泡時,可將其放在65水浴中浸泡幾分中,仍有氣泡或不能完全被濕潤(膜上有白色或黃色斑塊)則不能用於轉移。
轉移
1)取一個較大的方形瓷盤,放一塊玻璃板於盤上,盤內加轉移液(6×SSC或10×SSC)使液面距離玻璃底面約1,2cm,玻璃板表面蓋兩張預先用轉移液浸潤的Whatman 3M ·濾紙(也可用新華濾紙),濾紙兩端浸入SSC轉移液中,用一玻璃棒將濾紙壓平,濾紙與玻璃板間不得有氣泡,2)將瓊脂糖凝膠翻轉(樣品孔朝下)後置於上述鋪有Whatman 3M·濾紙的平台上,注意:兩者之間不能有氣泡。
3)用parafilm 蠟膜將凝膠四周平台上裸露的濾紙封嚴,防止在轉移過程中因短路(轉移液直接從盤中流向吸水紙而不經過凝膠)使轉移效率降低,甚至轉移失敗 ,
4)將處理好的NCP(已切去一角)小心地覆蓋在凝膠上(濾膜的光澤面即標有N.C字樣的一面朝向凝膠),NCP的一端與凝膠的上樣孔對齊,切去的一角與凝膠切角的位置對齊。 注意,濾膜與凝膠之間不能有氣泡,且NCP一旦與凝膠接觸即不可再移動,因為從接觸的一刻起,DNA已開始轉移,
5)將預先用轉移液浸潤過的與NCP大小相同的Whatman 3M濾紙覆蓋在硝酸纖維素膜上,排出濾紙與膜之間的氣泡,
6)再放幾張相同大小的乾濾紙和一疊厚約10,15cm的吸水紙於濾紙上,頂部壓一塊玻璃板和1kg左右的重物。
7)靜置12,15小時使其充分轉移,其間換吸水紙1,2次。轉移液在吸水紙的虹吸作用下從盤中轉移到吸水紙上,從而帶動DNA從瓊脂糖凝膠中轉移到NCP上,
8)轉移結束,移去吸水紙和濾紙,在NCP上用鉛筆標上點樣孔的位置。·將NCP浸泡在2×SSC中5分鐘以去除瓊脂糖碎塊。將膜放置於一張乾燥的新鮮濾紙上,
9)在紫外燈下觀察凝膠和NCP膜,以了解DNA轉移的情況。·在紫外燈下凝膠不顯示螢光,NCP膜呈桔紅色,並可見到條狀的DNA帶。
10)把NCP置於兩層乾燥新鮮的濾紙間,真空下80℃烘烤2小時(亦可用其它方法)。此過程可使DNA更加牢固地固定於NCP上。
11)此NCP既可直接用於雜交,亦可用塑膠薄膜密封,置,20℃冰櫃保存備用。
注意事項
1,操作時戴手套,嚴禁用手接觸凝膠和硝酸纖維素膜,2,轉移時,濾紙與膜、膜與凝膠、凝膠與濾紙橋之間均不能有氣泡,否則影響DNA轉移,
3,凝膠易碎,操作時應格外小心,
4,硝酸纖維素膜上的DNA固定非常重要,固定不好時DNA·在雜交過程中會脫落下來,烤膜溫度過高,膜脆性增加,易碎,
5,大片段DNA轉移效率低,可在鹼變性前用0.25mol/L HCl浸泡凝膠10,15分鐘,使DNA分子脫嘌呤或用短波(260mm)紫外光照射10,20分鐘後再行鹼變性、轉移以提高大片段DNA的轉移效率。
6,轉移液中鹽離子濃度對轉移有較大影響。10×SSC條件適中,能有效地轉移 1,20kb的DNA片段,速度也比20×SSC快,比較常用,6×SSC轉移速度最快,·對於高分子量DNA片段(>10kb)的轉移較理想,但小分子DNA易丟失。若轉移DNA片段較小 ,則宜選用20×SSC。因此應根據不同目的選擇適當的轉移液。
